葡聚糖凝胶G-10

葡聚糖凝胶G-10

注意事项：

葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。

葡聚糖凝胶G-10

有关操作说明

1、色谱柱装填

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体Z好做脱气处理。

（2）在柱下端加入蒸馏水，以除去柱中空气，关闭柱出口，在柱内保留少量蒸馏水。

（3）将介质连续倒入柱子时，要用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让介质自然沉降。

（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300cm/h，但是在使用中一般只用流速的75%。

2、固定金属离子

（1）金属离子的固定必须用过滤好的金属离子溶液，以防止金属盐在介质上沉淀。

（2）用2-5倍柱床体积的蒸馏水充分平衡柱子。

（3）选择合适的金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+等），溶解在中性或弱酸性的溶液中，浓度为0.1~0.3M。如果是Fe3+必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe3+产生沉淀。

（4）用2-5个柱床体积的金属离子溶液上柱，再用不少于5倍柱床体积的蒸馏水洗涤色谱柱，洗去未螯合的金属离子。（当然也可以把洗净没有螯合的填料直接和需要的金属离子溶液在摇床上震荡过夜，这样螯合效果更好，Ni-NTA Agarose尤其适合用这样的方法。）

（5）用2-5倍柱床体积的起始缓冲溶液平衡柱子，再上样。

（6）如果是螯合铁离子，要注意的是在中性条件下，Fe3+很容易被还原而生成沉淀，所以Fe3+溶液的pHZ好是3-5。螯合Fe3+的色谱柱不能长时间保存在中性溶液中。建议每次用完后都要将螯合的Fe3+用50 mMEDTA溶液洗净，下次使用时再重新螯合。如果洗不干净，也可以将介质浸在50mM的EDTA中过夜后再清洗保存。

3、上样

（1）样品通溶解在pH5.5~8.5的缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值，可以增大载量。

（2）选择起始缓冲液，主要是依据金属离子的特性及样品与金属离子的结合特性。

（3）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，也Z好不含巯基乙醇等还原剂。

（4）常用缓冲液有10~20m M磷酸钠盐缓冲液和50mM醋酸钠缓冲液

（5）在缓冲液中要加入0.15~0.5M的NaCl，以消除离子交换作用。

（6）使用金属螯合层析有一个通常的法则，如果不了解蛋白的结合特性，建议先选用Zn2+，缓冲液可以选择中性的磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，NaCl的含量为0.15-0.5M，作为起始缓冲液。

（7）缓冲液中的去污剂一般不会影响对蛋白的吸附作用。

（8）蛋白被吸附时，经常会有一部分的螯合金属离子被替换，这种现象通常是可见的，尤其是使用有色的金属离子时，比如Cu2+，所以使用几次后可以先把金属离子洗下来，然后再重新螯合金属离子。

4、洗脱

（1）线性降低或一步降低pH，大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来，也可以在pH3~4，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸、磷酸盐缓冲体系。

（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如0~0.5M咪唑，0~50 mM组氨酸，0~2M NH4Cl。梯度洗脱Z好在起始缓冲液的恒定pH下进行。

（3）EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来，这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。

（4）所有上述情况中，缓冲液中必须加入0.15~0.5M的NaCl 以消除离子交换作用。

（5）当螯合离子配基是Cu2+时

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