供应商:
康朗生物
数量:
大量
英文名:
Recombinant Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
保质期:
6-12months
保存条件:
-20℃
规格:
50ug/100ug/1mg
重组蛋白的制备
www.shklbio.com
应用重组DNA将目标基因进行表达得到的蛋白质成为重组蛋白,重组蛋白在生物信号传导过程,药物研发,科学研究中扮演着重要角色。下面来介绍一下重组蛋白的生产工艺流程。
1.基因扩增
(1)引物合成
搜索目标蛋白基因信息,结合蛋白的结构信息,选取片段或全长设计引物。注意避开跨膜区,以及复杂的二级结构,优选N端或C端,引物评分尽可能高,并搜索出核酸序列的酶切位点,使用载体等信息。经研发部根据研发经验提出修改意见ZZ定稿后交由第三方公司进行引物合成。
(2)基因克隆机重组鉴定
1)PCR
根据目的蛋白特异性表达组织,选取特异组织RNA用上述引物进行PCR扩增。进行琼脂糖凝胶电泳后,根据分子量大小选取目标片段进行切胶回收。再次PCR扩增,获得大量DNA,并进行PCR产物回收。
2)酶切,连接
根据酶切位点,将目标PCR产物以及相应载体进行酶切,获得粘性末端的DNA产物后,进行琼脂糖凝胶电泳,根据目标条带大小选取相应片段切胶回收。并将具有相同酶切位点的载体与DNA片段进行连接
3)转化,挑菌验证
将连接好的目的片段转化感受态E.coli,并在LB平板上进行过夜培养。挑取平板上的菌斑进行验证PCR,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据目标条带大小选取相应菌液进行测序,测序正确后留种保存。
2.蛋白表达
(1)蛋白表达小试
挑取少量菌种进行培养,并诱导表达,将表达的蛋白进行SDS-PAGE,根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达,小试表达成功后将进行蛋白预放大实验
(2)蛋白放大实验
将小试表达成功的蛋白菌株用400-800 ml培养基进行培养表达,进行SDS-PAGE,根据目标条带大小判断目标蛋白是否表达成功,预放大实验成功后将进行进一步的蛋白放大实验,放大实验使用800-1600 ml培养基进行培养,具体验证同上。
3.蛋白纯化
由于载体中包含了his标签,故采用镍柱进行纯化。有些蛋白可能会形成包涵体,在之前的一篇ZT中我们有详细介绍过大肠杆菌重组蛋白纯化方法,纯化后的蛋白会进行SDS-PAGE, BCA等实验分子量以及纯度进行验证,纯度超过95%。
4. 质量检测
获得蛋白后会进行冻干,冻干之后会进行常规蛋白实验进行验证,合格后保存。
重组蛋白的制备主要是依据以上原理及步骤。以上是以原核表达举例。在制备过程中每一个环节都至关重要,不同的蛋白会在不同的环节出现技术难点,包括目的基因的扩增,包涵体的形成都会对重组蛋白的研发造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研发经验,还可提供真核表达系统,哺乳动物细胞表达系统,用户可根据需要选择,同时对蛋白有特殊要求我们也可提供私人定制。
温馨提示:不可用于临床ZL。