禽流感病毒H7亚型血凝YZ试验抗原与阴、阳性血清

禽流感病毒H7亚型血凝YZ试验抗原与阴、阳性血清
禽流感病毒H7亚型血凝YZ试验抗原与阴、阳性血清
 
英文名　Avian Influenza Virus(H7 Sub-type) Hemagglutination Inhibition Test Antignen and Negative,Positive Sera 汉语拼音　Qinliugan Bingdu H7 Yaxing Xueningyizhishiyan Kangyuan Yu Yin,Yangxing Xueqing
 
【主要成分与含量】
 
抗原为灭活的H7亚型禽流感病毒，血凝效价≥7log2。阳性血清为SPF鸡感染禽流感病毒H7亚型制备的高免血清，HI效价≥7log2。阴性血清为SPF鸡血清。
 
【性状】 抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块；阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块。易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
 
【作用与用途】 用于HI试验检测禽流感病毒H7亚型抗体。
 
【用法与判定】
 
1 材料
 
1.1 96孔V型(90度)微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯等。
 
1.2 pH值7.2 0.01mol/L PBS
 
1.2.1 配制25倍PB 称量2.74g Na2HPO4 和0.79g NaH2PO。H2O，加蒸馏水至100mL；
 
1.2.2 配制1倍PBS 量取40ml 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000mL；
 
1.2.3 用NaOH或HCl调pH值至7.2；
 
1.2.4 69Kpa 15min高压灭菌或用微孔滤膜过滤CJ。
 
1.2.5 PBS一经使用，于2～8℃保存不超过3周。
 
1.3 阿氏（Alsevers）液 称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，加热溶解后调pH值至6.1，69Kpa 15min高压灭菌，2～8℃保存备用。
 
1.4 1%鸡红细胞悬液　　采集2～3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH值7.2 0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次均以3000rpm/min离心5min，洗涤后用PBS配成1%（V/V）红细胞悬液，2～8℃保存备用。
 
1.5 抗原溶解 冻干的抗原和血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。
 
2　操作术式
 
2.1 血凝（HA）试验
 
2.1.1 在V型微量反应板中，每孔加0.025ml PBS。
 
2.1.2 第l孔加0.025ml抗原，反复抽打3～5次混匀。
 
2.1.3 从第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。
 
2.1.4 每孔加0.025mL PBS。
 
2.1.5 每孔加入0.025mL 1%（V/V）鸡红细胞悬液。
 
2.1.6 将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，在室温（20～25℃）下静置20～30分钟或2～8℃ 45～60分钟。在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。
 
2.1.7 结果判定 将反应板倾斜60度，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌(凝集)的稀释倍数为血凝效价。
 
2.2 血凝YZ（HI）试验
 
2.2.1 根据HA试验测定的效价，计算配制4个血凝单位(4HAU)抗原。HA效价除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。例如，HA效价为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。
 
2.2.2 第1～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
 
2.2.3 第1孔加入0.025mL血清，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。
 
2.2.4 第1～11孔均加入0.025mL的4HAU抗原，在室温（20～25℃）下静置30分钟或2～8℃ 50分钟。
 
2.2.5 每孔加入0.025mL 1%（V/V）的鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温（20～25℃）下静置20～30分钟或2～8℃ 45～60分钟，对照红细胞将呈明显钮扣状沉于孔底。
 
3 结果判定
 
以完全YZ4 HAU抗原的血清稀释倍数判为该血清的HI效价。当阳性对照血清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清效价不高于21og2时，试验方可成立。被检血清HI效价≤31og2判为阴性；＝41og2判为可疑(可疑样品应重检，重检效价≥41og2判为阳性，≤31og2判为阴性)；≥51og2判为阳性.
 
【注意事项】
 
（1）HA和HI试验影响因素甚多，应严格控制试验条件。每加一试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。
 
（2）准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。（3）用pH值7.0～7.2的PBS作为稀释液。
 
（4）抗原和阴、阳性血清若有污染，应废弃。
 
（5）准确配制4HAU抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。
 
（6）抗原和血清按规定保存。冻干试剂应按规定的体积用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超过1个月；可分装成小包装，-70℃冻存，随用随取。切忌反复冻融。
 
（7）鸭、鹅以及哺乳动物的血清一般需进行非特异性凝集和YZ素的处理。
 
（8）同一亚型不同毒株的HI试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的HI效价不同。
 
【废弃包装处理措施】
 
剩余的试剂及空瓶不能随意丢弃，须经加热或消毒灭菌后方可废弃。
 
【规格】
 
（1）1ml/瓶
 
（2）2ml/瓶
 
【包装】 10瓶/盒、24盒/箱。
 
【贮藏与有效期】
 
　-15℃以下保存，有效期为24个月。