小鼠干扰素γ（IFN-γ）ELISA试剂盒

【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中小鼠干扰素γ(IFN-γ)的浓度。
 
【检验原理】
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗小鼠 IFN-γ 单克隆抗体预包被在 高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样 本中存在的 IFN-γ 与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶 标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物 TMB，避光显色。颜色反应的深浅 与样本中 IFN-γ 的浓度成正比。加入终止液终止反应，在 450 nm 波长测定 吸光度值。
 
检测范围
31.2pg/ml→2000pg/ml
灵敏度
检出剂量小于1.43pg/mL。

【主要组成成分】
主要成分

组分	规格	数量
包被微孔板	96T	1板
标准品	0.9ng/450uL	2管
抗体	80uL	1管
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素	150uL	1管
10×检测缓冲液	5mL	1瓶
标准品稀释液	5mL	1瓶
TMB显色液	10mL	1瓶
TMB终止液	10mL	1瓶
洗涤缓冲液(20X)	30ml	1瓶
封板膜		4张

注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致
  样本类型和采集
细胞培养上清
 300 g 离心 10 分钟去除沉淀物，即刻检测, 或者分装，-20℃以下贮存。
血清样本
分离管分离血清。在 1000 g 离心之前，使血样凝集 30 分钟。吸取血清样本之后即刻检测，或 者分装，-20℃以下贮存。
血浆样本
EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1000 g 离心 3 0 分钟收集样本。即刻检测，或者 分装，-20℃以下贮存。 本试剂盒可能适用于其它生物学样本。
细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。
注意：检测前，样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。 样本应分装并贮存于-20℃，以避免小鼠 IFN-γ 活性的丢失。如果在 24 小时内检测，样本可以 存放在 2 - 8℃。 避免样本的反复冻融。在检测前，冷冻样本应该缓慢地恢复至室温，轻柔地混匀
小鼠IFN-γ 标准品
用蒸馏水或去离子水重溶小鼠 IFN-γ标准品，重溶体积标注在小鼠 IFN-γ标准品的标签上（0.9ng/450uL）。轻柔 地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶后标准品的浓度为2000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释 前充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。
标准曲线制作
血清/血浆样本标准曲线的制作：
取 250 μl 浓缩的小鼠 IFN-γ标准品，加入 250 μl 标准品稀释液，作为标准曲线的浓度 (1000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移 液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。 细胞培养上清样本标准曲线的制作：
取 250 μl 浓缩的小鼠 IFN-γ标准品，加入 250 μl 细胞培养基，作为标准曲线的浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1：1 系列稀释。每次移液 时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。
 
【检测步骤】
检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。
1. 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。
 2. 将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。
3. 加入 300 μl 1×洗液静置浸泡 30 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后， 在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。
4. 复孔加入 100 μl 2 倍倍比稀释的标准品。空白孔复孔加入 100 μl 标准品稀释液。 5. 样本孔加入 80 μl 1×检测缓冲液和 20 μl 样本。
6. 每孔加入 50 μl 稀释的检测抗体。保证步骤 4、5、6 连续加样，不要间断。加样过程在 15 分 钟内完成。
7. 使用封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 2 小时。
8. 弃掉液体，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗涤 6 次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的 实验性能，必须彻底移除残留液体。
9. 每孔加入 100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
10. 使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 45 分钟。
11. 重复步骤 8。
12. 每孔加入 100 μl 显色底物 TMB，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。
13. 每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均 匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。
14. 在 30 分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定 450 nm 吸收波长和 570 nm 或 630 nm 参考波长下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。 仅使用 450 nm 测定会导致 OD 值偏高，并且准确度降低。
【结果计算】
计算标准品和样本的平均 OD 值，然后减去零浓度标准品的 OD 值。 以标准品浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。回归分 析确定拟合曲线。通过对浓度值和 OD 值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程 可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确度会降低一些。
注意：标准曲线浓度点的终浓度为 1000 pg/ml。如果完全按照说明书的步骤操作 (20 μl 样本 + 80 μl 检测缓冲液)，计算样本浓度时请乘以稀释因子 5。 如果样本按照说明书进行了稀释，的稀释倍数为 5。如果样本进行了其它方式的稀释，计 算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。