质粒DNA纯化试剂盒

产品及特点
本试剂盒是用于质粒DNA小量制备与纯化的试剂盒。菌体先经碱裂解法处理，再通过离心吸附柱，专一结合DNA，洗去杂质，GX快速提取质粒DNA，全套操作可以在30分钟之内完成。使用本试剂盒可从1-5 mL过夜培养的菌液纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA（OD260/OD280 = 1.8-2.0），可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。
1. 快速、步骤少，整个操作在半个小时之内完成。
2. 不需要预平衡离心吸附柱。
3. 洗柱液即开即用，不需要额外加乙醇。
4. 纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8-2.0之间。
5. 产量高，每毫升过夜培养的细菌可以提取到2-5 ug/mL。
6. 用途广，适用于低拷贝和高拷贝质粒。
7. 价格低，比多数国内同类产品的价格更便宜。
规格及成分
成 份
50次包装 （CAT#:60205-50）
100次包装 （CAT#:60205-100）
溶液A
13 mL
26 mL
溶液B
13 mL
26 mL
溶液C
18 mL
36 mL
RNase A溶液 （10 mg/mL）
1.5 mL
1.5 mL×2
通用洗脱液
5 mL
10 mL
通用（DNA）洗柱液
50 mL
100 mL
高载量离心吸附柱
50套
50套
使用手册
1份
1份
运输及保存
常温运输和保存，RNase A需要-20℃保存，有效期一年。
自备试剂
无
使用方法
1. 先将全部RNase A溶液全部加入到溶液A中，摇匀后再取用，未用完的溶液AZ好在4℃保存。
2. 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养12-16小时（摇床转速200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统处理能力而降低DNA质量。另外，延长培养时间有利于提高质粒DNA浓度，但是菌液培养过长时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
3. 用1.5 mL离心管收集1-4 mL过夜培养饱和菌液，室温12,000 rpm离
心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
4. 加入250 uL溶液A，用枪头充分吹打使菌体重悬（此步在冰上操作效果更佳）。注意：细胞未充分悬浮会影响后续操作，可以使用漩涡振荡器帮助混匀或使用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀。
5. 加入250 uL溶液B（如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀4-6次，看到溶液变粘即可，然后冰上放置不超过4-5分钟。注意：此步处理不能超过5分钟，否则DNA的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH，降低其效率）。
6. 加入350 uL冰上预冷的溶液C，反复颠倒混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后冰上放置至少5分钟。
7. 转速（12,000 rpm以上）4℃离心5分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。如果此步的离心在室温进行，更容易出现沉淀物漂浮的现象。
8. 静置2分钟以让质粒DNA与吸附柱充分结合，此步十分重要。
9. 室温12,000 rpm离心1分钟，弃收集管中的废液。
10. 加入500 uL的通用洗柱液，室温12,000 rpm离心1分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。
11. 重复上步1次。
12. 室温12,000 rpm离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。
13. 将离心吸附柱置于一个新的1.5 mL塑料离心管（自备）中，加入30-100 uL 65-80℃预热的DNA洗脱液，室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。
14. 室温12,000 rpm离心1分钟，离心管底溶液即质粒DNA。
15. 由于天泽基因的吸附柱结合DNA能力较强，如果再加适量DNA洗脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多质粒DNA（相当于次洗脱的20-30%），但注意不要使用上步得到的DNA洗脱液来洗脱。
疑难解答
可能出现的问题
可能原因
建议解决方法
琼脂糖凝胶上可见RNA帶
RNA降解不彻底
适当补加点RNase到溶液A中
产物中有大分子量的DNA污染
加入溶液B后有剧烈震荡或裂解时间过长
加入溶液B后不要猛烈振荡或搖匀，可轻轻颠倒离心管6-8次使充分混匀,并且时间一般在5分钟之内。
在琼脂糖凝胶上点样时，质粒漂出点样孔
洗脱步骤后，乙醇没有完全从柱子上去除
DNA洗脱前离心柱必须干甩一次。
DNA产量低
菌体量过多 细菌裂解率低
只使用含有氨苄青霉素的LB或YT培养基。使用时，不要使用超过4 mL的高拷贝质粒培养物或8 mL低拷贝质粒培养物(一般用过夜培养物1.5 mL)。 在加入溶液A后细胞没有充分混匀，可漩渦振荡悬浮液使之充分混匀。 加入溶液B后，延长裂解时间,使裂解液澄清即可,一般不会超过5分钟。 如果溶液B没有盖紧，可能需要重配。可按以下准备：0.2N NaOH，1% SDS。
使用的是低拷贝数质粒
若5 mL过夜培养物的产量小于0.5 μg，增加培养物的体积至10 ml。
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