人血管内皮细胞生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒（Human VEGF ELISA Kit）

使用前彻底阅读说明书。本酶联免疫试剂盒是基于经典酶联夹心技术原理，能测量人VEGF，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

【工作原理】

VEGF
VEGF，血管内皮细胞生长因子。VEGF是Z重要的血管生长因子之一。二个亚单位由二硫键连接，组成分子量46-48KDa的糖蛋白质。VEGF有多个亚型。根据其亚单位所含氨基酸数量的不同，分别命名为VEGF121，VEGF144，VEGF165，VEGF189和VEGF206等。提供的ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（ELISA）。预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体也为多克隆抗体，经生物素（biotin）标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。
【每套试剂盒中内容】(96T)

材料 数量
人VEGF标准品 96T(2vial)
预包被人VEGF抗体的96孔板 96T（8×12）
生物素标记人VEGF抗体 96T (1:100)
ABC（亲和素-过氧化物酶复合物） 96T (1:100)
样品稀释液 96T×2
人VEGF抗体稀释液 96T×1
ABC稀释液 96T×1
TMB显色液A 96T×1
TMB显色液B 96T×1
TMB终止液 96T×1
ELISA专用洗涤液 96T×1(1:25)

人血管内皮细胞生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒（Human VEGF ELISA Kit）
【需要而未提供的试剂和器材】
1． 37℃恒温箱。
2． 标准规格酶标仪。
3． 自动洗板机。
4． 单通道或多通道可调节移液器以及其吸头。
5． 蒸馏水，容量瓶等
6． 干净的试管和Eppendof管。

【注意事项】
1. 从-20℃取出的试剂盒，Z好在4℃解冻过夜。盒内每一瓶解冻的溶液在开启瓶盖之前都要轻轻摇匀，避免解冻时出现的分层，否则会出现浓度不均一的现象。
2. 开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。
3. 配制各种试剂时，切记混匀！
4. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
5. 建议所有人VEGF标准品、样本都做双份检测。
6. 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活！
7. 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

人血管内皮细胞生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒（Human VEGF ELISA Kit）
【洗板方法】
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

【样品的准备和保存】
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液，室温凝固2小时或4℃过夜，离心1000×g 10分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞培养、组织匀浆、体液——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

【样品稀释的一般原则】
用户须查阅文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于elisa试剂盒的检测范围。样品的稀释应有详细记录。

【试剂的准备和保存】
A. 人VEGF标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。将冻干品管内加入1ml样品稀释液，彻底溶解后做倍比稀释。
稀释后的人VEGF标准品在2小时内使用。

B．生物素标记人VEGF抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul生物素标记人VEGF抗体加人VEGF抗体稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实配时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液990ul的比例配制工作液。轻轻混匀。

D. TMB显色工作液的准备：在使用之前30分钟，按TMB显色液A 9份加 TMB显色液B 1份的比例配制TMB显色工作液。

人血管内皮细胞生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒（Human VEGF ELISA Kit）
【操作程序】
1． 确定本次检测所需的已包被人VEGF抗体的酶标板孔数目。
2． 将倍比稀释的人VEGF标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
3． 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4． 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
5． 将准备好的生物素人VEGF抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7． 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见人VEGF标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔。（显色反应Z长不要超过30分钟）。
10． 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
11． 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

【操作程序总结】：
准备试剂，样品和人VEGF标准品

加入准备好的样品和人VEGF标准品，37℃反应90分钟

洗板2次，加入生物素化人VEGF抗体工作液，37℃反应60分钟

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30分钟

洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应

加入TMB终止液

30分钟之内读OD值

计算标本待测因子含量

人血管内皮细胞生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒（Human VEGF ELISA Kit）
【检测范围】：2000pg/ml→31.2pg/ml。
【敏感性】： ＜15pg/ml
【特异性】： 系统和其它细胞因子无交叉反应。
【保存】： -20℃ [短期内（如两周）可4℃
【有效期】： 12个月（-20℃）。
【用途】： 用于体外定量分析液体标本（通用型）。

【参考文献】
Science 246:1306-1309(1989)
Science 246:1309-1312(1989)
J. Biol. Chem. 266:11947-11954(1991)
Mol. Endocrinol. 5:1806-1814(1991) 
J. Biol. Chem. 272:7151-7158(1997) 
Mol. Biol. Cell 9:469-481(1998) 
Clin. Sci. 97:303-312(1999)
Nat. Methods 5:1011-1017(2008)
Nature 425:805-811(2003)