Klenow 片段 (3′→ 5′ exo-)

 数量： 大量
保质期： 一年
保存条件： -20℃保存
规格： 200U
Klenow 片段（3´→5´exo-）是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。它保留了DNA 聚合酶活性，但失去了 5´→3´ 外切核酸酶活性。该酶经突变（D424A）去除了其 3´→5´ 的外切核酸酶活性。具体有下列特点：1. 用随机引物制备探针2. 随机引物标记法3. 合成 cDNA 第二链4. 诱变反应中第二链的合成5. 双脱氧法 DNA 序列测定（Sanger 法）

酵母与原核之间在重组蛋白的生产成本上的比较要看具体情况。KLENOW 片段 (3´→ 5´ EXO-)传统的酿酒酵母与大肠杆菌相比产量多数情况下处于劣势。但毕赤酵母高密发酵特性突出，表达量则常常超过大肠杆菌系统，如果实现GX分泌表达，则纯化成本非常低，具有生产成本优势。但毕赤酵母的胞内表达在纯化方面则不一定有优势。

KLENOW 片段 (3´→ 5´ EXO-)除了用于规模化生产重组蛋白之外，毕赤酵母还在基础研究方面发挥着重要 作用，比如表达蛋白用于结构分析，信号传导途径研究，当然也包括酶学研究。用酵母或原核系统对于活性未知的酶进行研究的例子少，一般酶活鉴定往往是用天然的蛋白解决的。

如果需要，完全可以利用毕赤酵母进行酶活性的探索，从以往的战绩来看，毕赤酵母表达表达成功的例子实在是太多了，KLENOW 片段 (3´→ 5´ EXO-)比例也很高，虽然仍存在风险。

1）原核诱导时间，从你的结果来看，诱导1-5小时变化不大，时间点影响较小，取3小时没有问题。很多情况下，温度对可溶性影响较大，不知道你30度诱导的可溶性如何？如果蛋白主要是可溶性的，那进一步降低诱导温度的意义也就小了。如果仍有较多的包含体，KLENOW 片段 (3´→ 5´ EXO-)倒是可以再降低一下诱导温度。此外，很多蛋白包含体复性后有活性，如果可溶性表达困难或表达量太低，仍可以考虑包含体复性策略。

2）酵母细胞的破壁可以采用机械法，也可以采用酶法。机械法主要是高压匀质和珠磨，主要用于中试和生产，但有的仪器也可以兼顾实验室规模，这两种方法效率较高。酶法主要用于制备球形体，是一种外源基因GX转化的方法，KLENOW 片段 (3´→ 5´ EXO-)但用于破壁检测表达则成本太高，此外使用酶破壁也会引入杂蛋白。我查过一篇文献，是小量裂截用于表达检测的，我没有直接作过，但我们实验室的研究生反映还可以。

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