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细胞试验有限稀释法(limiting dilution analysis,LDA)具体步骤
实验步骤:
1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板(可提前24小时准备就绪,置CO2培养箱中备用);
2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞(亦可自24孔培养板孔中收集),制成悬液。
3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数,一般在105/ 毫升左右。
4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上,先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升,再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞,即每0.1毫升1个细胞。
5、每孔0.1毫升细胞悬液。
6、置37℃5%CO2培养箱,4天后取出观察,并在板盖上打上标记,做好记录并统计结果。
7、继续培养时,则在第4-5天更换1/2培养基,约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次。
8、选择单克隆生长孔,生长良好,阳性强者,转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。
有限稀释法的程序
①制备饲养细胞悬液
②转染了重组质粒后的细胞计数,并调细胞数在1~5×103/ml
③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬 液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加 2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。
④培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。
⑤第8~9天时,肉眼可见细胞克隆。
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