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1、卵黄琼脂培养基用途：

卵黄琼脂培养基（Egg yolk agar base）用于厌氧梭状芽孢杆菌的分离培养和卵磷脂酶试验。

2、培养基配制方法：

（1）基础培养基

肉浸液　　　　　　　　1000mL

蛋白胨　　　　　　　　15g

氯化钠　　　　　　　　5g

琼脂　　　　　　　　　25～30g

pH7.5

（2）50%葡萄糖水溶液。

（3）50%卵黄盐水悬液。

制法：制备基础培养基，分装每瓶100mL。121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每瓶内加入50%葡萄糖水溶液2mL和50%卵黄盐水悬液10-15mL，摇匀，倾注平板。

3、50%卵黄盐水悬液配制方法

（1）买新鲜鸡蛋，用流水将蛋壳表面洗净，沥干；

（2）将洗净的鸡蛋放于70%乙醇中浸泡1h；

（3）以无菌操作取出蛋黄，加等体积无菌0.9%氯化钠溶液（生理盐水）；

（4）混匀后置4°C贮存备用。

4、检测原理

蛋白胨和*粉提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供能源；氯化钠维持均衡的渗透压。将产气荚膜梭菌划线接种于卵黄琼脂平板上，厌氧培养后，由于产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂并生成不溶性甘油酯形成乳白色的混浊带，因此会在菌落周围及底部形成乳白色的混浊带。

可溶性抗原与相应抗体持异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应(precipitation)。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。与相应的抗体相比，抗原分子小(<20pm) ，单位体积中所含抗原量多，具有较大的反应面积。为了使抗原抗体之间比例适合，不使抗原过剩，故一般均应稀释抗原，并以抗原稀释度仍能与抗体出现沉淀反应为该抗体的沉淀反应效价 (滴度)。

琼脂扩散(agar diffusion)为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。当对应的抗原、抗体在半固体琼脂终相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，再适当的部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散不仅用于疾病的诊断，更广泛地用于抗原成分的分析。

免疫琼脂双向扩散是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生待异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线(图1)。如果所加抗原和抗体标本中分别含有若干与血清学反应无关的抗原抗体，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的Z适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，—条沉淀线代表一对抗原抗体。因此，通过双向免疫扩散试验，用已知抗体(或抗原)检测未知抗原(或抗体)，可鉴定抗原性物质或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。

免疫琼脂双向扩散实验原理、方法、结果观察与注意事项

图1 双向琼脂免疫扩散试验示意图。左图为模式图，右图为实际试验的结果。上，两个抗原孔里含有相同的抗原，沉淀线是不分叉的；中，两个抗原孔里的抗原完全不同，沉淀线分叉；下，两个抗原孔里的抗原部分相同，沉淀线部分交叉。

一、试验材料

1、1%生理盐水琼脂。

2、人血清( 1:20 )，兔抗人IgG。

3、载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器等。

二、实验方法

1、琼脂板的制备：将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂4ml，倾注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器按图2打孔，孔径3mm，孔距距15mm。

2、加样：于ZY孔加入人血清（抗原），周围1-5孔加入不同浓度的兔抗人IgG（抗体），6孔加入生理盐水作对照。

3、扩散：将琼脂板放入湿盒内，置37°C温箱中24小时后取出观察结果。

免疫琼脂双向扩散实验原理、方法、结果观察与注意事项