大鼠P53（P53）ELISA定性试剂盒使用说明书

大鼠P53(P53)ELISA定性试剂盒使用说明书相关实验研究：

补肾调冲方对环磷酰胺致卵巢储备功能低下大鼠P53、GnRHR的影响
摘要：目的 1探讨补肾调冲方对环磷酰胺致卵巢储备功能低下大鼠卵巢组织衰老基因P53、促性腺激素释放激素受体GnRHR的影响;2观察P53、GnRHR在卵巢储备功能低下大鼠卵巢中的表达情况,为中医药临床ZL卵巢储备功能低下提供理论依据和思路。方法 随机将12周龄清洁级雌性SD大鼠120只分为空白组,模型组,造模中组补肾调冲方高、中、低剂量组,造模后组补肾调冲方高、中、低剂量组,西药组,每组各10只。除空白组正常喂养外,其余各组大鼠均按75mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺每日1次,共1日(14d造模结束)制备大鼠卵巢储备功能低下模型。其中造模中组即在造模的同时按照24、12、6g/kg的剂量给予补肾调冲方灌胃预防;造模后组即在造模14天结束后给予剂量24、12、6g/kg的补肾调冲方灌胃ZL,两组均连续灌药36d后观察大鼠一般情况;西药组按结合雌激素0.075mg/kg给予灌胃,方法同补肾调冲方灌胃方法。
试剂盒的组成： 
（1）结合物及标本的稀释液；
（2）洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水；
（3）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（4）酶的底物；
（5）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），elisa试剂盒参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（6）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）
用途：科研与实验专用试剂，不得用于临床诊断。
检测种属：人、大小鼠、兔、羊、猴、猪、豚鼠ELISA检测试剂盒等种属。
标本：血清、血浆、细胞上清液、尿液、体液、灌洗液、脑脊髓、心房水、胸房水、组织等。 
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大鼠P53(P53)ELISA定性试剂盒使用说明书双抗体夹心ELISA法定量测定人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体含量。

液体类标本：
包括血清，血浆，尿液，胸腹水，脑脊液，细胞培养上清液等。
血清：
室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中如有沉淀，请再次离心。
血浆：
应根据标本的要求选择EDTA，柠檬酸钠或者肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，在离心20分钟（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，请再次离心。
尿液：
用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，请再次离心。
细胞培养上清：
检测分泌性的成份时，用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，当细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，使细胞破坏并释放细胞内的成份，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，请再次离心。
组织标本：
切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后仍保持2-8℃的温度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，分装后留一份待检测，其余冷冻备用。

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ELISA试剂盒的包被条件与封闭：包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的Z适当浓度随载体和。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的Z适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。Z常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其Z大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。 
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底ZG。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。