现货供应哈维氏弧菌核酸检测试剂盒
◆注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★分区之间进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照下述方法处理样品。
一. 直接检测
1. 病灶组织
(1)若对样本不增菌直接进行检测，则取患病动物的病灶组织做匀浆备用。
2. 水体
1）取10～100mL养殖水，用筛网过滤，取滤液通过0.22um的硝酸纤维膜过滤；
2）将滤膜剪碎振荡重悬于500 μL 0.9% NaCl水溶液或无菌生理盐水，12000 rpm 离心5 min，尽量弃净上清液。
二. 增菌检测
取待检样品25g（mL），加入225mL的 TYE液体培养基，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1 min，或者拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵或均质袋中磨碎，再加入10mL TYE液体培养基，于摇床培养24h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
1.1不增菌直接检测
请参照水生动物病害基因组DNA快速提取试剂盒说明书的提取步骤。
1.2 增菌后检测
1）取增菌液1~2 mL，10000 rpm 离心5 min，弃上清液；
2）加入500 μL 无菌0.9% NaCl水溶液或医用生理盐水，10000 rpm 离心5 min，尽量弃净上清液，保留管底沉淀；
3）混匀提取液后，向管底沉淀中加入100 μLDNA提取液，剧烈涡旋混匀，100℃加热10 min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10 min；
4）10000 rpm离心2 min，将上清转移至新的离心管中低温保存备用或现场完成检测。
2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
取出所需测试数的已含有反应液的PCR管，将试剂完全解冻，解冻后打开管盖向各管管底分别加入1μL B-I，盖上管盖离心1 min。打开管盖分别沿各管管壁上加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG-VH-I。盖好PCR管盖后，离心3 min，立即进行PCR扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器63℃条件下反应30 min。
②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，30个循环。
若使用其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①恒温仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有哈维氏弧菌；若显示“阴性”，则样品中不含有哈维氏弧菌或含量低于检测限。如在20min~30min间出现曲线上扬而自动判读结果为阴性，可能由于样品含量较低导致，建议对样品进行富集或延长反应时间至45min进行复核。
②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有哈维氏弧菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有哈维氏弧菌或含量低于检测限。
- NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
- 现货供应哈维氏弧菌核酸检测试剂盒
