CK-04 日本同仁CCK-8试剂盒

一. 制作标准曲线（测定细胞具体数量）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加日本同仁CCK-8试剂盒试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）

二. 细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃,5% CO₂）。

2、向每孔加入10 μL 日本同仁CCK-8试剂盒溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

三. 细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO₂）。

2、向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并

遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。