RM-1小鼠前列腺癌细胞|RM-1细胞动物

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细胞名称：RM-1小鼠前列腺癌细胞|RM-1细胞动物

细胞缩写： RM-1细胞

详细背景： 这株细胞的细胞骨架染色突出呈现肌动蛋白，在细胞质中有丰富的平行微丝。有报道称在1uM血管紧张素II存在下，它们会收缩。细胞在软琼脂中形成克隆，SV40大T抗原阳性。

细胞来源： 细胞主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国内外大学建系

"购买细胞注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，RM-1小鼠前列腺癌细胞|RM-1细胞动物显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和公司技术部沟通交流。

规格： 复苏T25培养瓶(一瓶)或冻存1ml冻存管（两支）

细胞规格： 1*10(5)/ml——1*10（6）/ml

上海素冉生物科技有限公司是一批由美国留学归来的致力于服务ZG生物领域的青年创办的一家新型公司。公司自创办以来，以优质的产品、快捷的速度和完善的售后服务，赢得生物界老师的厚爱，您选择素冉的理由： 产品齐全：囊括实验室仪器、设备、实验室耗材、免疫生物学试剂、动物生物学试剂、植物生物学试剂、微生物学试剂、细胞生物学试剂、遗传学生物试剂、生物化学试剂、分子生物学试剂。 品Pai齐全：囊括国内外100多个知名品Pai。 方便、快捷，订货周期短，选择服务质量好的快递，全称跟踪，及时到达您的手中。素冉生物努力打造生物领域内的京东商城。 平价：同等质量的产品，我们这里价格实惠，为您节省每一分钱。 优质的售后服务：实验过程，我们有技术全程跟踪指导，若有问题，我们时间为您处理，保证您售后无忧。 多姿多彩的技术服务：免疫学技术服务、Western Blotting技术服务、实时荧光定量PCR(RealTime PCR)技术服务、病理学检测技术服务等。 总之，素冉生物是您值得信赖的地方：诚实正直，以客户的切身利益为出发点，关注客户，协助客户一起成长！

小鼠细胞培养实验步骤
一般培养-保持胚细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞
明胶包被
细胞传代
体外分化
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)
体外分化方法
注:以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系,其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol,需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有LIF(白血病YZ因子)和Feed细胞的培养基(高糖)来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1:8的比率传代细胞一次,细胞传代以后,在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前,通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时,使分化细胞粘附,从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃,5%CO2,湿度条件下培养。如果在Feed 细胞,那么就需要采用MMC进行处理,YZFeed细胞增殖,但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基
ES:
配制一20×不含DMEM,HS,LIF的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml 离心管中,(稀释为2×,每管42ml),贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液,HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基,0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃,时间不要超过2周。
贮存液
DMEM(高糖)
马血清(HS)
L-谷氨酰胺(200mM)
MEM NEAA(10mM)
HEPES(1M)
β-巯基乙醇(55Mm)
PEST
LIF
复苏细胞
细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成,结晶的形成会损害细胞。然而,二甲基亚砜对细胞有毒性,快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤:
1.从液氮中取出一管细胞;
2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟(或放到管内溶液恰好完全溶解);
3.将细胞转移到一15ml Falcon管中;
4.加入5ml ES培养基(用培养基冲洗冻存管);
5.离心3分钟;
6.弃上清,用2ml ES培养基重悬细胞,至少吹打10次;
7.接种在明胶包被(见下文)的6孔或6cm组织培养皿;
8.孵育。
冻存细胞
冻存液
90%HS和10%DMSO
步骤:
1.1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内;
2.用细胞刮刀收集细胞;
3.将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟;
4.弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中(10 cm的培养皿用2ml,15cm的培养皿用6-7ml。)
5.分装于冻存管内,每管1ml;
6.置-80℃过夜,第二天移入液氮。
Geltin(明胶)包被
准备500ml 0.1%geltin溶液
1.将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中(50-65℃水浴15~30分钟)。
2.在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤,贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1.加入足量的明胶溶液覆盖培养平面(15 cm培养皿加2ml,10 cm培养皿加0.5~
1 ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆盖培养表面就行了。);
2.置室温30分钟;
3.去除明胶溶液,将培养板贮存在包装袋中室温放置,注意将板子平放或倒扣,以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代
建议每2天传代细胞一次,过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率,我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞,在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前,通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1.去除培养液;
2.无钙镁PBS(Gibco)洗涤;
3.加入胰酶EDTA(Gibco)。37℃孵育5分钟。
4.加入ES培养基使胰酶失活;
5.将细胞转入15 ml离心管中离心3min;
6.去除上清,将细胞重悬于2 ml ES培养基,至少吹打10-20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向,传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7.将细胞接种在没有包被的组织培养皿中(使用和一开始同样规格的培养皿)放入温箱2小时(分化细胞在该时间内将黏附,而ES细胞仍将保持悬浮); 8.将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开(前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向)
9.建议按1:4-1:10的比率传代 (ATCC)
保持细胞的传代比率很重要,以我们的经验,1:8的比率是好的,可以使细胞的自然分化降到。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1
来计算传代比率。
体外分化
胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在Z少量的培养基内选择(第3步),在有bFGF存在的情况下扩增(第4步)并分化在第5步。细胞全程培养在37℃,5%CO2,湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化,也可以采用低浓度的RA进行诱导。
时间线(总时间为27~34天)
第2步;4+1天第3步;4-10天第4步;4天第5步;10-15天
体外向心肌细胞方向分化
胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化,小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞,与胚胎发育时间线是完全一致的。
培养基
EB
配制一20×不含DMEM,FBS,LIF的溶液(该溶液也能用于ES培养基--见前述)。分装在50ml 离心管中,(稀释为2×,每管42ml),贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基,0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。贮存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺(200mM)
MEM NEAA(10mM)
HEPES(1M)
β-巯基乙醇(55Mm)
PEST(P104U/mlS104μg/ml
ITSFn and N3(分化培养基):
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中,(稀释为1×,ITSFn 7.05ml,N3 12.55ml),0.2μm滤膜过滤,贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基,贮存于4℃。
贮存液
DMEM(高糖)
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒suan钠300μM
黄ti酮(20μM)
腐胺(100μM)
PEST(P104U/ml S104μg/ml)
层粘连蛋白100μg/ml
纤维连接蛋白250μg/ml
碱性rhFGF, 10μg/ml
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
ITSFn and N3培养基贮存液的准备
使用无菌的溶剂和稀释液,在分装之前要对溶液进行过滤,如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤,需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液溶剂,贮存液,稀释剂和储存
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒suan钠300μM
黄ti酮(20μM)
腐胺(100μM)
PEST(P104U/ml S104μg/ml)
层粘连蛋白(100μg/ml)
纤维连接蛋白(250μg/ml )
碱性rhFGF, (10μg/ml)
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)
包被液的准备
多聚-L-赖氨酸,15μg/ml
把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白,1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500m l 1×PBS混合。
包被过程:
1.加入多聚-L-赖氨酸,至少2-3小时(过夜也行)
2.吸出多聚-L-赖氨酸
3.加入纤维结合蛋白,大约1-2小时
4.吸出纤维结合蛋白,放置30分钟晾干
5.贮存在4℃
24孔板用200μl,6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
体外分化方法
第1步:ES培养基
在LIF存在的条件下维持细胞培养
第2步:EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1.分散纯化细胞(参见上面的细胞传代部分)
2.纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中,计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3.用2mlEB培养基重悬细胞,吹打至少10次制成单细胞悬液
4.一个15cm的细菌培养皿接种4~5×106个细胞(1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿)。
5.2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3~5分钟使细胞沉降。弃去上清,将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6.用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中(这即是细胞的移植步骤)。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿,在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
第3步--ITSFn培养基
在Z少量培养基中选择神经前体细胞
1.在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
2.并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附,因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3.保持细胞在ITSFn中培养大约10天,根据需要更换培养基--大约每隔一天。观察细胞形态,神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时,转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现个清晰的标志几天以后,通常是在第3步的第6到第10天。
第4步-N3培养基+bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤,加入1-2ml 胰酶
2.37℃孵育5分钟
3.用4mlEB培养基终止胰酶活性,将细胞转入锥形管中放置3~5分钟移出细胞团,将上清移入一新的离心管离心。