AB荧光桃红染色法粘多糖染色试剂盒

研究真核基因的Z基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前Z通用的方 法是 5′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman 发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下， 利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 5′-端序列。本试剂盒 就是根据 5′-RACE 原理而开发，
AB荧光桃红染色法粘多糖染色试剂盒具有下列特点： 1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。
AB荧光桃红染色法粘多糖染色试剂盒的原理如下图：

自备试剂：Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、B、C、75%乙醇。
注意：自备的 基因专一性引物 A，B，C 的相对位置应该跟本手册产品介绍中的示意图一致。 运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。

5’RACE试剂盒使用方法
1. 变性模板 RNA：将 1 μg mRNA 或 5 μg 总 RNA 加入到一个 RNase-free 的 PCR 管中，补 RNase-Free 水到 9 μL，65℃保温 5 分钟后短暂离心，立即放 冰上待用。如果 RNA 浓度偏低，体积超过 9 μL,可以使用本公司的核酸浓缩剂 （需另购,产品编号为 110801-30）浓缩到所需的体积。
2. 设置 RT 反应（用户可以根据需要设阴性对照）：在上步的含变性后的 RNA 模 板的 PCR 管中，按顺序加入：
3. 37℃保温 60 分钟， 42℃保温 30 分钟， 50℃保温 10 分钟，Z后 75℃保温 10 分钟使逆转录酶变性。短暂离心 5 秒后待用。
4. 在 PCR 管中加入 40 μL 微量核酸沉淀剂（本产品含不溶的核酸助沉剂，用前 需要充分摇匀再取用），震荡混匀。
5. 室温12000 rpm离心15分钟，小心吸弃上清。此步沉淀可以去除多余的dNTP。
6. 加入 1mL 自备 75%乙醇，室温 12000 rpm 离心 5 分钟，小心吸弃上清。
7. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入 20 μL RNase-free 水， 充分吹打溶解，得到 cDNA 溶液待用。注意：为保证加尾效率，溶解 cDNA 的 RNase-free 水Z不要超过 20 μL。
8. 在两个塑料离心管中按下表设置加尾反应（强烈建议做一组加尾阴性对照管）
9. 37℃保温 15 分钟进行加尾反应，然后 75℃保温 3 分钟灭活末端转移酶。 10. 分别加入 0.5 mL RNase-free 水稀释样品管和对照管中的加尾反应产物。此稀 释液将作为 PCR 的模板。 11. *轮 PCR：按下表分别使用不同体积的样品管稀释液和对照管稀释液做模板 设置 PCR 反应（单位：μL，下表只列出以样品管稀释液为模板的反应）。
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