PCR 反应的影响因素
两管式 RT-PCR 试剂盒 (AMV-Taq)50 次介绍变性温度与时间:
模板变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度,达不到变 性温度就不会产生单链 DNA 模板,PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全, DNA 双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况 下可设为 94℃ 20~30 秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热 DNA 聚合酶的活力, Z高变性温度不宜超过 95℃。 退火温度与时间:退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物 不能与模板牢固结合.
DNA 扩增效率下降;
温度低产量高,但过低可造成引物与模板 错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的Z 适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引 物的熔解温度 Tm 低 5℃,退火时间一般为 30~60 秒,足以使引物与模板之间完全结 合,长时间退火没有必要。
延伸温度与时间:
PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间,延伸时间根据所用 聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增 2 Kb 片段,若使用 Taq 酶只需 1 分钟,使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现, 时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数:
可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设 定 20-40 个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加, 非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
酶量:
50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶,酶量的选择与模板 DNA 的量,扩增片段大 小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高 保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。
两管式 RT-PCR 试剂盒 (AMV-Taq)50 次介绍产品及特点:
易错 PCR(error-prone PCR)是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR 的比较如下:本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错 PCR 而开发,本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错 PCR 的突变率为 0.66% (±0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在 PCR 引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4. 可用于连续易错 PCR(sequential error-prone PCR),只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增 1kb 以下的产物,对于 1kb 以上的产物,建议分段扩增。
两管式 RT-PCR 试剂盒 (AMV-Taq)50 次介绍介绍:
两管式 RT-PCR 试剂盒 (AMV-Taq)50 次介绍注意:
1.如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。
2.如果 DNA 模板中有 PCR 不明YZ物(植物、土壤和血液等 DNA 样品常含此类 YZ物),可以在 PCR 体系中加入 1/10 的 PCR YZ物清除剂(CAT#:60804, 30uL 体系中加 3uL),可能会对 PCR 有帮助。使用方法:
1. 以 30 uL 的标准 PCR 反应体系为例,如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的 PCR 管中,加入下列成分:易错 PCR Mix, 10× 3 uL 易错 PCR 专用 dNTP, 10× 3 uL MnCl2, 5 mM 3 uL 自备 DNA 模板(10ng/uL) 1 uL PCR 引物(自备,10 uM each) 10 pmol each Taq DNA 聚合酶(5U/uL) 1 -5 U 补水到 30 uL
2. 按已经优化的 PCR 条件进行一定循环数的 PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取 5 uL 电泳检查。如果没有优化的 PCR 条件,一般可以先尝试下面的 PCR 条件: PCR 前变性 94℃ 3 分钟易错 PCR 94℃ 1 分钟 45℃ 1 分钟 循环 30 次(见注) 72℃ 1 分钟注:易错 PCR 一般不需要热启动,也不需要在 PCR 结束后做延伸处理。
3. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。
HCT-8/V? 人结肠癌长春新碱耐药株
CL-0115Hs 746T(人胃癌细胞)5×106cells/瓶×2
人前列腺平滑肌细胞(HPSMC)(5×105)
小鼠源细胞 大鼠晶状体上皮细胞完全培养基 100mL
犬胸腺细胞;cf2Th
INHBA Others Mouse 小鼠 Activin A 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
大鼠胰岛细胞瘤细胞;INS-1
人脉络丝内皮细胞 (HCPEC)( 5×105 )
大隐静脉平滑肌细胞Many types of cells包装:5 × 105次方(1ml)
人导管癌细胞;ZR-75-1 大鼠结肠平滑肌细胞完全培养基 100mL
CT-26 WT 小鼠结肠癌细胞
HAVCR1 Others Cynomolgus 食蟹猴 HAVCR1 / TIM1 / TIMD1 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
GHR Others Rat 大鼠 Growth Hormone Receptor / GHR / GHBP 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
CL-0076EAC(小鼠艾氏腹水癌细胞)5×106cells/瓶×2
EpiFectagen? 上皮细胞转染试剂盒
HO-8910PM细胞,人高转移卵巢癌细胞 小鼠肉瘤细胞,S37细胞 肾实质细胞Many types of cells包装:5 ×105次方(1ml)
CTLL-2(小鼠T细胞) 5×106cells/瓶×2
HBEpC Pellet 人支气管上皮细胞团块 > 1 mio.cells 人肺动脉成纤维细胞cDNAHPAF cDNA
CL-0076EAC(小鼠艾氏腹水癌细胞)5×106cells/瓶×2
GHR Others Rat 大鼠 Growth Hormone Receptor / GHR / GHBP 人细胞裂解 (阳性对照) (变性)
EpiFectagen? 上皮细胞转染试剂盒
HO-8910PM细胞,人高转移卵巢癌细胞 小鼠肉瘤细胞,S37细胞 肾实质细胞Many types of cells包装:5 ×105次方(1ml)
CTLL-2(小鼠T细胞) 5×106cells/瓶×2
HBEpC Pellet 人支气管上皮细胞团块 > 1 mio.cells 人肺动脉成纤维细胞cDNAHPAF cDNA
赖酸铁琼脂(LIA)250g用于食品中沙门氏菌生化试验(FDA标准)
完全琼脂培养基 250g 用于纺织品微真菌影响评价试验
煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLB) Brilliant Green Lactose Bile Broth 250 用于大肠菌、大肠杆菌的测定(SN标准)
霉菌和酵母菌显色培养基l/瓶incubationmedia霉菌和酵母菌显色培养基l/瓶
ContactPlateMedium
胰蛋白胨水培养基250g用于靛基质试验
产芽孢肉汤 250(g) incubation media 产芽孢肉汤 250(g)
MR-VP试验用培养基 MR VP Broth 250克 肠杆菌科细菌的甲基红和VP试验
副溶血性弧菌增菌液250用于副溶血性弧菌的增菌培养incubationmedia副溶血性弧菌增菌液250用于副溶血性弧菌的增菌培养
MLCB寒天培地 250g 用于沙门氏菌分离培养
放线菌培养基(改良高氏50g用于放线菌的分离培养
20012-043 1000ml incubation media 20012-043 1000ml
甲型副伤寒沙门氏菌 支/瓶
MRSAgar
SabouraudsAgar
两管式 RT-PCR 试剂盒 (AMV-Taq)50 次介绍酪蛋白琼脂28370用于鉴别蜡样芽孢杆菌分解酪蛋白试验(GB/T4789.28-2003中4.65,GB/T4789.03)。
紫色麦康凯肉汤 (US 配方) (CM0006a) Oxoid incubation media 紫色麦康凯肉汤 (US 配方) (CM0006a) Oxoid
宋氏志贺氏菌 模式菌株、分类研究,减少碱类 支/瓶
Aium
XLDMedium