PCR 优化试剂盒1套型号注意:
1.如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。
2.如果 DNA 模板中有 PCR 不明YZ物(植物、土壤和血液等 DNA 样品常含此类 YZ物),可以在 PCR 体系中加入 1/10 的 PCR YZ物清除剂(CAT#:60804, 30uL 体系中加 3uL),可能会对 PCR 有帮助。
PCR 反应的影响因素
PCR 优化试剂盒1套型号变性温度与时间:
模板变性温度是决定 PCR 反应中双链 DNA 解链的温度,达不到变 性温度就不会产生单链 DNA 模板,PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全, DNA 双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况 下可设为 94℃ 20~30 秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热 DNA 聚合酶的活力, Z高变性温度不宜超过 95℃。 退火温度与时间:退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物 不能与模板牢固结合.
DNA 扩增效率下降;
温度低产量高,但过低可造成引物与模板 错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的Z 适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引 物的熔解温度 Tm 低 5℃,退火时间一般为 30~60 秒,足以使引物与模板之间完全结 合,长时间退火没有必要。
延伸温度与时间:
PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间,延伸时间根据所用 聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增 2 Kb 片段,若使用 Taq 酶只需 1 分钟,使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现, 时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数:
可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设 定 20-40 个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加, 非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
酶量:
50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶,酶量的选择与模板 DNA 的量,扩增片段大 小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高 保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。
产品及特点:
易错 PCR(error-prone PCR)是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和 MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR 的比较如下:本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错 PCR 而开发,本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错 PCR 的突变率为 0.66% (±0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在 PCR 引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4. 可用于连续易错 PCR(sequential error-prone PCR),只需把上一次易错 PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增 1kb 以下的产物,对于 1kb 以上的产物,建议分段扩增。
介绍:
![](http://item.yiqi.com/pic/ConPic/2/636223442987185932755.jpg)
使用方法:
1. 以 30 uL 的标准 PCR 反应体系为例,如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的 PCR 管中,加入下列成分:易错 PCR Mix, 10× 3 uL 易错 PCR 专用 dNTP, 10× 3 uL MnCl2, 5 mM 3 uL 自备 DNA 模板(10ng/uL) 1 uL PCR 引物(自备,10 uM each) 10 pmol each Taq DNA 聚合酶(5U/uL) 1 -5 U 补水到 30 uL
2. 按已经优化的 PCR 条件进行一定循环数的 PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取 5 uL 电泳检查。如果没有优化的 PCR 条件,一般可以先尝试下面的 PCR 条件: PCR 前变性 94℃ 3 分钟易错 PCR 94℃ 1 分钟 45℃ 1 分钟 循环 30 次(见注) 72℃ 1 分钟注:易错 PCR 一般不需要热启动,也不需要在 PCR 结束后做延伸处理。
3. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。
Amyloid Precursor Protein 淀粉样肽前体蛋白抗体
Aquaporin 2 水通道蛋白-2抗体
AGT 血管紧张素原抗体
Androgen receptor 雄激素受体抗体
AVEN 细胞死亡调节蛋白抗体(凋亡、半胱胺酸蛋白酶激活YZ剂)
Axin1 轴蛋白1抗体
ATG9B 自噬相关蛋白9B抗体
Apg12 自噬相关蛋白12抗体
ATG13 自噬相关蛋白13抗体
ATG3 自噬相关蛋白3抗体
ADAMTS4 整合素样金属蛋白酶与凝血酶4型抗体
phospho-ATF2 (Ser490/498) 磷酸化活化复制因子2抗体
phospho-Amyloid Precursor Protein (Tyr757) 磷酸化APP(Tyr757)淀粉样肽前体蛋白抗体
ACTR 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR抗体
ADAM18 去整合素样金属蛋白酶18抗体
ATF6 活化转录因子6抗体
AP2 beta 衔接蛋白β抗体
Gamma-Adaptin 衔接蛋白γ/γ-Adaptin抗体
AQP9 水通道蛋白-9抗体
Annexin A3 膜粘连蛋白A3抗体
Annexin IV 膜粘连蛋白 A4抗体
APG8A 自噬相关蛋白8A抗体
phospho-Akt (Thr450) 磷酸化蛋白激酶B抗体
phospho-AMPK alpha-1 (Thr198) 磷酸化腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1抗体
phospho-Akt(Thr308) 磷酸化蛋白激酶B抗体
APOBEC3G 脱氧胞苷脱氨酶蛋白抗体
AKAP13 蛋白激酶锚定蛋白13抗体
AP1M2 AP-1μ2抗体
Allergin-1 肥大细胞膜YZ性受体Allergin1抗体
ACCN1 脑钠通道蛋白1抗体
水解酶结构域蛋白15抗体 TNFRSF18 ELISA Kit 肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)ELISA试剂盒
肺α/β水解酶蛋白3抗体 TNFsR-Ⅱ ELISA Kit 肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅱ(TNFsR-Ⅱ)ELISA试剂盒
三磷酸腺苷结合盒转运蛋白F亚基3抗体 TNFsR-Ⅰ ELISA Kit 肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ(TNFsR-Ⅰ)ELISA试剂盒
三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A亚基5抗体 TL1A/TNFSF15 ELISA Kit 肿瘤坏死因子超家族15(TL1A/TNFSF15)ELISA试剂盒
ADCK1蛋白抗体 TNFγ ELISA Kit 肿瘤坏死因子γ(TNFγ)ELISA试剂盒
酰基辅酶A结合结构域蛋白4抗体 TNF-β ELISA Kit 肿瘤坏死因子β(TNF-β)ELISA试剂盒
α/β水解酶4抗体 TNFβ ELISA Kit 肿瘤坏死因子β(TNFβ)ELISA试剂盒
ADCK2蛋白抗体 TACE ELISA Kit 肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)ELISA试剂盒
乙醛脱氢酶16家庭A1抗体 TNF-α ELISA Kit 肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒
粘附分子IgG样结构域蛋白3抗体 TNFα ELISA Kit 肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒
乙醇脱氢酶1抗体 TACSTD2 ELISA Kit 肿瘤关联钙信号转导因子2(TACSTD2)ELISA试剂盒
δ氨基乙酰丙酸脱水酶抗体 TP53 ELISA Kit 肿瘤蛋白p53(TP53)ELISA试剂盒
肌萎缩侧索硬化症相关蛋白4抗体 CA724 ELISA Kit 肿瘤标志物(CA724)ELISA试剂盒
α2巨球蛋白抗体 NEP ELISA Kit 中性内肽酶/脑啡肽酶(NEP)ELISA试剂盒
ACCSL蛋白抗体 NAP-2/CXCL7 ELISA Kit 中性粒细胞趋化蛋白2(NAP-2/CXCL7)ELISA试剂盒
甲胎蛋白抗体 NGAL ELISA Kit 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)ELISA试剂盒