一步法96 孔板单菌落质粒DNAout（ 真空法）1次实验方法

一步法96 孔板单菌落质粒DNAout( 真空法)1次实验方法使用方法:

1. 将 10-30 mL 新鲜或解冻后的抗凝全血加入到 50 mL 塑料离心管中。
2. 12000-15000 g 室温离心 5 分钟，弃上清(血浆)。
3. 将 20 mL 溶液 A 加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解。
4. 将 6 mL 的溶液 B 和 4 mL 加入到离心管中，剧烈震荡 30 秒。
5. 12000-15000 g 室温离心 3-5 分钟，将上清液(为无色或浅红色)转移到另一干净离心管中。注意：转移的液体不要超过 25 mL，否则下一步不能加入等体积的溶液 C。为防止污染，Z好留少量上清液。下层有机相一般呈深红色，中间层为白色，含有 DNA，蛋白质和其他细胞破碎物，避免触及或吸取。
6. 加入等体积的溶液 C，充分颠倒混匀。
7. 分两次将溶液转移到离心吸附柱中，每次转移后 12000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加 25 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 重复步骤 8 一次。
10. 室温 12000-15000 g 离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响 RNA 的后续反应。
11. 将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入 1mL RNA 洗脱液，室温放置 1-2 分钟。
12. 12000-15000 g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。
14. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。人血 RNA 产率一般为 2-5 ug/mL。
15. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 2.0 左右(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。
一步法96 孔板单菌落质粒DNAout( 真空法)1次实验方法产品介绍：

一步法96 孔板单菌落质粒DNAout( 真空法)1次实验方法产品及特点:
本产品是天泽基因在柱式血液 RNAOUT（CAT#：71202）基础上开发的大提升级产品，专门从动物全血样品中快速提取总 RNA。跟柱式血液 RNAOUT 相比，本产品具有下列特点：
1. 大量提取，每次Z多可处理 30mL 血液。
2. 操作简单快捷，直接使用新鲜的或冷冻的抗凝全血样品，不需要裂解红细胞等任何预处理步骤，整个提取过程只需要十分钟左右，可以全在室温下进行。
3. 纯度高，OD260/OD280 均在 2.0 左右，得到的 RNA 可以直接用于 RT-PCR 和 Northern 杂交等研究。
4. 产率一般为 2-5ug/mL 人血。 5. 与常用的抗凝剂（包括肝素，EDTA，柠檬酸钠，草酸钠）兼容。 
一步法96 孔板单菌落质粒DNAout( 真空法)1次实验方法血液 RNA 提取方法及注意事项血液：
RNA 提取的方法可以细分为需要预先处理和不需要预先处理两类。众所周知，人和其他哺乳动物血液只有白细胞（不到总数的 5%）等少量细胞含有 RNA，需要预先处理的血液 RNA 提取法其实就是分离白细胞再提取 RNA，本质上是白细胞 RNA 提取。分离白细胞的方法有 Ficoll-Hypaque 密度离心法（白细胞在 Buffy Coat 中)和红细胞裂解法。由于预处理操作会剧烈改变血液 RNA 含量（British J. Haematol.， 126:231， 2004），所以无预处理提取法将是未来提取血液 RNA 的发展方向。白细胞 RNA 提取和全血 RNA 提取都需注意以下问题：
一、血液越新鲜越好，因血液细胞内外都有大量 RNase，容易使 RNA 降解。血液在 4℃的放置时间Z好不要超过四天；
二、尽可能YZ或灭HX液特有的 RNase（如 EDN， ECP），因为它们不但跟 RNase A 一样非常稳定，而且不被 RNase Inhibitor 和 RVC YZ，还能YZ逆转录酶的活性，它们残留在 RNA 样品中不但会降解 RNA，还会干扰后续的 RT-PCR 反应；
三，血液富含糖蛋白，粘蛋白和血红蛋白，提取需要去除糖蛋白污染；四，由于 RNA 量少，提取时很容易丢失，可以适当使用核酸沉淀助沉剂；五，血液细胞量随生理病理因素变化波动性大，注意调整血液和提取试剂的Z佳用量。Z简单的方法是使用已经经过厂家优化的产品，比如用于白细胞 RNA 提取的 TRIzol、QIAamp RNA Blood Mini Kit 和天泽基因的动物 RNAOUT；用于全血 RNA 提取的 TRIzol LS，PAXgene Blood RNA Kit 和天泽基因的全血 RNAOUT 和柱式血液 RNAOUT。

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