Pfu DNA polymerase说明书
(Rev.C)
货号 | 规格 | 储藏/有效期 |
PD6202-5rxns | 5rxns | -20℃/一年 |
PD6202-100 rxns | 100 rxns | -20℃/一年 |
PD6202-5×100 rxns | 5×100 rxns | -20℃/一年 |
产品组成
组成 | PD6202-5rxns | PD6202-100 rxns | PD6202-5×100 rxns |
Pfu DNA Polymerase | 50μl | 250μl | 5×250μl |
10×PCR Buffer | 100μl | 1 ml | 5×1 ml |
6×Loading Buffer | - | 500μl | 1 ml |
产品说明:本产品是90 kDa的耐热性Pfu DNA聚合酶及配合其使用的10×PCR Buffer以及6×Loading Buffer。与其它在PCR反应中使用的聚合酶相比,Pfu聚合酶有着出色的热稳定性,以及特有的"校正作用"。与TaqDNA聚合酶不同,PfuDNA聚合酶具有3'-5'外切酶的即时校正活性,可以即时的识别并切除错配核苷酸。保真性是普通Taq酶的20倍以上。本产品具有超高保真性、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。
活性定义: 一个单位(U)的DNA聚合酶的活性定义为在74℃,30分钟内,以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,摄入10nmol的全核苷酸所需的酶量。
质量控制: SDS-PAGE检测纯度大于99%;经检测无外源核酸酶活性;PCR方法检测无宿主残留DNA;能有效扩增人类基因组中的单拷贝基因;室温放置一周,活性无明显改变。
适用范围: 一般DNA的片段的扩增、DNA标记、DNA序列测定。
建议的PCR反应体系: (以50μl反应体系为例)
模板DNA(2.5ng-100ng) | 1μl |
Forward Primer (10 μM) | 2μl |
Reverse Primer (10 μM) | 2μl |
dNTP (10 mM ) | 1μl |
Pfu DNA polymerase | 2μl |
10×PCR Buffer | 5μl |
ddH2O | 补足到50μl |
50 μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量
大肠杆菌基因组DNA | 10 ng~100 ng |
λDNA | 0.5 ng~5 ng |
质粒DNA | 0.1 ng~10 ng |
建议的PCR反应条件
步骤 | 温度 | 时间 | |
预变性 | 95℃ | 3 min |
变性 | 95℃ | 30 sec | 25-35 cycles |
退火 | 50-70℃ | 30 sec |
延伸 | 72℃ | 1-5min(1min/kb) |
终延伸 | 72℃ | 5min | |
保温 | 4/16℃ | --- |
注意事项:
1、本产品提供的酶量可进行多次反应,配置过程应将酶尽量放在-20℃冰盒中。
2、PCR的反应液请在冰上配制,然后置于PCR扩增仪上进行PCR反应。这种冷启动法(Cool Start Method)可增强PCR扩增的特异性,减少PCR过程中的非特异性反应,能得到良好的PCR结果。
3、PCR反应后,加入本产品提供的6×Loading Buffer按5:1混合均匀后加入凝胶孔进行电泳。
可能出现的问题及解决方案:
- 假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备②引物的质量与特异性③酶的质量 ④PCR循环条件。寻找原因应逐个排除。 - 假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。原因可能是引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。 - 出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。其原因:一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。Mg2+浓度或者重新设计引物即可解决。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。也需逐个排除。
Pfu DNA Polymerase