产品编号:HL20024.2.1
名称:基因甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒
规格:60次
价格:客服
技术背景
在基因的启动子区域(promotor region)通常存在一些富含重复双核苷酸“”的区域,称为“岛”( island)。在人类基因组内,存在有近3万个岛。这些岛不仅是基因的一种标志,而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构,更是DNA甲基化的*位置。岛甲基化形态的扫描分析是基因表达和表观基因组学的主要课题。
产品内容
扩增液(Reagent A) 微升
补充液(Reagent B) 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里;有效保证6月
用户自备
转化样品:经过亚硫酸盐转化的目标DNA分子
特异引物:用于甲基化基因扩增的引导DNA分子
PCR仪:用于样品扩增
PCR管或平板:用于PCR反应的容器
实验步骤
实验开始前,从-20℃冰箱中取出试剂,放进冰槽里融化。然后进行下列操作:
- 针对一个样本,每次移出xx微升扩增液(Reagent A)到PCR管
- 加入1微升用户自备的的转化或野生型DNA样品(总量100纳克)
- 分别加入1微升用户自备的甲基化特异性的引物F和引物R(各350纳克或25微摩尔)
- 再加入xx微升补充液(Reagent B)(反应总量为25微升)
- 即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒,速度为500g(或2000RPM;例如eppendorf 5415)
- 加入50微升PCR级矿物油(注意:参见注意事项10)
- 即刻进行热启动PCR反应:
温度(℃) | 时间 | 循环 |
95 | 9分钟 | 1 |
95 Tm 72 | 30秒 30秒 30秒 | 35 |
72 | 5分钟 | 1 |
- 反应完毕后,移取5微升进行1.8%琼脂糖凝胶电泳或15%聚丙烯酰胺凝胶
- 如果进行测序鉴定,胶回收PCR产物(建议使用高质纯化一步法胶回收试剂盒;HL20051.1)
- 分别移出2微升反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管(每微升100纳克)
- 加入1微升用户自备的甲基化特异性的巢式引物F(每微升350纳克)到其中一个1.5毫升离心管,作好标记
- 加入1微升用户自备的甲基化特异性的巢式引物R(每微升350纳克)到另一个1.5毫升离心管,作好标记
- 进行后续的直接测序反应
注意事项
- 本产品为60次操作
- 操作时,须戴手套
- 建议使用带滤芯的枪头,避免污染
- 转化后的DNA样本须保存在-20℃冰箱里,否则容易降解;同时尽快进行扩增等后续操作
- 一个特定基因的甲基化检测通常包括转化、PCR和直接测序三步。PCR用于筛选和定位,可以发现0.1%甲基化;测序是精确定位,是分析金标准
- 一个特定基因的甲基化特异性PCR通常包括三组PCR:
- 甲基化特异性PCR的引物设计原则:引物以SENSE的DNA链为模板;引物含有足够多的C(后面不和G相连);引物含有1-3个位点;位点须在3端;PCR片段长度在80-250碱基;三组引物取自同一位点,通过长度变化获得相同的Tm,并在电泳上有所区别。
- 直接测序的引物设计原则是:引物不能含有位点;引物含有足够多的C(不和G相连);采用巢式引物
- 基因甲基化区域选择原则:如果是一个首次检测的基因,首先,选择启动子部位;第二,选择足够多的位点;第三、
- 通过1.8%琼脂糖凝胶或15%聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测PCR扩增后的结果。假如DNA样品在修饰前是未甲基化的,那么仅仅“U”Primers将产生扩增产物;相反,已甲基化的DNA样品仅仅用“M”Primer能被扩增
- 组织样品或杂合子样品常常出现“U”和“M”同时呈现阳性;建议使用基因甲基化程度定量分析试剂盒(HL20024.3)予以分析
- 根据用户PCR仪的性能,决定是否加入矿物油(Mineral Oil)
- 建议使用软件测算Tm温度;在-20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
- 本公司提供甲基化特异性引物设计服务
- 本公司同时提供数字化表观基因组完全分析(全部甲基化基因)技术试剂盒和外包服务(HL90002)
- 本公司提供系列甲基化分析试剂产品
质量标准
- 本产品经鉴定性能稳定
- 本产品经鉴定转化保证
- 本产品经鉴定无核酶污染
- 本产品经鉴定反应产量高