蓝耳病ELISA试剂盒特异性

蓝耳病ELISA试剂盒特异性实验流程：

1.使用无菌水将包被液稀释为1×（注意：预先将包被液平衡至室温）。

2.用1×包被液稀释功能级别的包被抗体，包被ELISA板子，每孔100ul，盖板，四度孵育。

3.第二天稀释检测稀释液（双蒸水稀释），吸出板子的捕获抗体溶液，用300ul洗液洗板3-5次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

4.200ul检测稀释液封闭板子，盖板，室温孵育1小时。

5.吸去检测稀释液，用300ul洗液洗板3-4次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

6.按照上述说明使用1×检测稀释液稀释标准品（严格按照说明书进行）。

7.加100ul样品和标准品到对应的孔中，封板，室温孵育2个小时或4度（高灵敏度）。

8.孵育期间，按照说明书准备检测抗体。

9.吸去样品，用300ul洗液洗板5次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

10.每孔加100ul检测抗体，封板，室温孵育1个小时。

11.孵育期间，按照说明书准备抗生物素的HRP溶液。

12.每孔加100ul抗生物素的HRP溶液，封板，室温孵育0.5个小时（避免溶液中有叠氮钠，因为会影响HRP活性）。

13.吸去溶液，用300ul洗液洗板3-4次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

14.每孔加100ulTMB溶液，封板，室温孵育15min（注意：TMB要预先平衡至室温）。

15.加50ul终止液终止。

16.加终止液后30min内检测，450nm读板。

蓝耳病ELISA试剂盒特异性间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

1将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗　　体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

4加底物显色

本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。

间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。