环保型质粒小量提取试剂盒

产品组分

● *N1021的SolutionⅠ中已预混RNase A，可直接使用。4℃保

存6个月。

● 溶液Q与溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含

60%乙醇。

● 上述产品组分均可单独购买，详见产品索引。

● RNase A的浓度为10mg/ml。

产品说明

本产品是新型环保、无毒害的质粒DNA小量纯化试剂盒。实验过程涉及的试剂既不会伤害皮肤，也不会污染环境，确保您能够在健康、安全的环境中轻松完成实验。同时，本产品能够有效地保护质粒DNA的完整性，提取的超螺旋质粒一般在90%

以上。一次可从1-5 ml过夜培养的菌液中提取10-30 μg高纯度质粒DNA（OD_260/280 = 1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

质量控制

从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

保存条件

本产品除RNase A外，其余组分可室温保存1年以上。RNaseA

为浑浊溶液，室温运输，-20℃保存。初次使用本试剂盒时，请

将RNase A 全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后于4℃可保

存6个月。

若SolutionⅡ出现沉淀，请于37℃保温溶解，待恢复至室温后

使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

● SolutionⅠ在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀后4℃保存，可保存6个月。N1021的SolutionⅠ中已预混RNase A，可直接使用。

● 溶液Q与溶液W次使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇，即3 ml溶液Q与溶液W中各加入4.5 ml无水乙醇，30 ml溶液Q与溶液W中各加入45 ml无水乙醇，40 ml溶液Q与溶液W中各加入60 ml无水乙醇，用后立即盖紧盖子。

● 若SolutionⅡ出现沉淀，请于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

● 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如为高拷贝质粒，建议使用2 ml菌液，可提取10-15 µg质粒。低拷贝质粒或大于10 kb质粒，建议使用5-10 ml菌液（按照比例增加SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ的用量），可提取4-6 µg质粒。溶液Eluent 应在65℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当延长时间，以提高提取效率。其它步骤相同。

● 本产品适用于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌中的质粒DNA提取。由于革兰氏阳性菌外被一层较厚的细胞壁，会严重影响碱裂解细菌细胞的效率。因此，必须在碱裂解细胞前用溶菌酶（N9021）消化细胞壁。处理方法为：离心收集适量菌体，弃上清，加入100 μl SolutionⅠ，充分振荡悬浮菌体。加入溶菌酶使其终浓度为10-20 mg/ml左右，37℃处理30min。溶菌酶的浓度和处理时间可根据菌株的不同与具体的实验条件加以调整。

● 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm。

● 溶液Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。

● 为了保证回收效率，请不要使用未调整pH值的超纯水洗脱目的片段。

● 请严格遵照操作步骤操作。

操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1  用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min，弃上清。

●  应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化

时影响质粒纯度。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

2  加入100 μl SolutionⅠ/RNase A混合液，涡旋剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。

●  初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。N1021的SolutionⅠ中已预混RNase A，可直接使用。

●  不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

●  室温静置1-2 min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3  加入250 μl SolutionⅡ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

●  若SolutionⅡ出现沉淀，请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

●  不可剧烈混合，否则会使染色体DNA断裂，造成基因组污染。

●  此步骤不宜超过5 min。

4  加入250 μl SolutionⅢ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

5  12,000 rpm室温离心3 min，收集上清。将上清转移至一个新的1.5ml离心管中，加入等体积（600 μl）无水乙醇，颠倒3-5次完全混匀。

6  将步骤5所获混合液全部置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。

●  混合液体积超过DNA纯化柱容积（700 μl），应将混合液分次加入DNA纯化柱中。

7  12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

●  此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。

8  加入500 μl 溶液Q，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

●  溶液Q初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。

●  此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

9  加入500 μl溶液W，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

●  溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。

10  加入500 μl溶液W，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。

11  12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

12  将DNA纯化柱置于新的1.5ml离心管中。向纯化柱ZY处，悬空滴加50-100 μl溶液Eluent，室温放置2 min。12,000 rpm离心2 min，管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20℃保存。

●  溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

●  对溶液Eluent 65℃预热,会提高提取质粒的产量。