co-IP免疫共沉淀

co-IP免疫共沉淀

应用简介

Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作为常见的分子互作验证方法。它们可以从检验的出发点来区分：co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白检测体内相关蛋白、DNA、RNA，并通过蛋白抗体免疫沉淀分离目标蛋白、DNA、RNA。Pulldown则是根据已知RNA（RNA pulldown）或者已知蛋白（GST pulldown）体外检验相关蛋白。

Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，是IP实验的一种扩展， 基于IP反应的潜力，在样品溶液中捕获和纯化主要目标（抗原等）及通过天然相互作用与靶标结合的其他的大分子。此外，还可以利用Co-IP来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。

免疫共沉淀co-IP

免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein G或A能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于磁珠的Protein G或A，若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白，就可以形成蛋白复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein G或A”；通过免疫印迹实验来检测目的蛋白。

实验方法

Step1: 蛋白样品准备，细胞需提前裂解

Step2: 抗原抗体结合

Step3: protein G磁珠与抗体结合

Step4: 免疫沉淀分离

Step5: 洗脱蛋白复合物

Step6: WB或质谱分析

案例展示

图一：A蛋白带有GFP标签，B蛋白带有FLAG标签，GFP蛋白作为阴性对照。用GFP抗体作为IP抗体，结果显示：Input组组样本中表达B蛋白和阴性对照GFP蛋白，第二组样本表达A和B蛋白；IP实验之后，只由第二组样本检测到了A蛋白和B蛋白，同时GFP阴性对照无结果，说明A蛋白和B蛋白之间存在相互作用。

技术总结

1、实验样品制备方法准备：很重要！根据研究目的，检测样品可能是组织样品，也可能是细胞样品，不同样品制备流程不太相同，目的蛋白表达量也有较大差别，必须选择合适的样品和样品制备方法。

2、根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体：非常重要！用于Co-IP实验的抗体是针对目的蛋白的特异性抗体，Z理想的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体，且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖，比普通WB抗体要求高出很多；同时，抗体特异性和灵敏性尽可能高，才有可能有干净的背景和较好的IP效果，所以必须选择Z适合的抗体用于Co-IP实验。