抗凝全血基因组DNA提取试剂盒（0.1-20ml血液)

特别提示：包括抗凝全血基因组DNA提取试剂盒（0.1-20ml血液)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：抗凝全血基因组DNA提取试剂盒（0.1-20ml血液)
英文名称：Extraction kit for genomic DNA from Blood anticoagulated
产品货号：WH0013
产品规格：50mL血|200mL血

本试剂盒采用独特的缓冲液系统，提取0.1-20ml加入各种抗凝剂的新鲜血液和冻存血液样品基因组DNA。本缓冲液系统可限度去除蛋白、色素、脂类及其他YZ性杂质污染。提取的基因组DNA片段大，产量高，纯度好，稳定可靠。本试剂盒避免使用běn酚、lǜ仿等有机溶剂，回收的DNA可适用于各种常规操作，如酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

提取得率：（根据血液样品中白细胞数量的不同，DNA产量有所差异）

材料	保存时间	提取量	DNA产量	OD260/OD280
人类全血	4℃一周	300μl	3-10μg	1.7-1.9
人类全血	4℃一周	1 ml	4-30 μg	1.7-1.9
人类全血	4℃一周	5 ml	100-200 μg	1.7-1.9
人类全血	4℃一周	10 ml	200-400 μg	1.7-1.9

试剂盒组成：

组分	5ml血量	200ml血量
细胞裂解液CL	125 ml	2×250 ml
缓冲液FG	30 ml	120ml
洗脱缓冲液TB	30 ml	60 ml
Proteinase K	250 μl	1 ml

保存条件：室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1．血液样品反复冻融，会导致提取的DNA片段较小、且提取量下降。所得基因组DNA也应尽可能避免反复冻融，以免断裂。
2．血液样品的储存：
  a)短期保存：已加入抗凝剂的血液样品可在2-8℃储存Z多10天，对于某些实验例如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2-8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。
  b)长期保存：已加入抗凝剂的血液请置于-70℃保存（如果提取的是高分子量的DNA，推荐使用EDTA作为抗凝剂）
3．所有离心操作均可在室温下完成。

使用方法：

一、小体积全血操作流程（<600 μl血样；以300μl血液处理量为例）
1．向300μl抗凝剂的血液中加入750 μl细胞裂解液CL，颠倒混匀5次。
  注意：为方便与离心机配套使用，可加入与血液等体积的细胞裂解液CL,重复裂解两次。
2．12000rpm（~13400×g)离心1 min。倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2 min，确保沉淀在管中（此步骤应小心操作，为避免沉淀被倒出，推荐使用尖底离心管）。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清，将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁上清的回流。
3．按照表1配制缓冲液FG与Proteinase K的混合液。
  注意：此混合液Z好现用现配，并在配好后1h之内用完。
4．加入150 μl缓冲液FG与Proteinase K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
  注意：当处理多个样品时，加入缓冲液FG和Proteinase K的混合液后要立刻涡旋混匀，不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀5sec就足以混匀沉淀，但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀，此时可再次补加缓冲液FG和Proteinase K的混合液（具体补加量见表1），再次涡旋混匀。
5．65℃水浴10min，其间颠倒混匀数次。
  注意：随着蛋白的消解，溶液的颜色从红色变为黄绿色。
6．加入150 μl异丙chún，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
  注意：与异丙chún完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该仔细观察。对于白细胞数目很少的样品，DNA沉淀可能看不到，此时应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7．12000rpm（~13400×g)离心5 min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保沉淀在管中。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清。如果样品的白细胞数量足够多，可以看到白色的DNA沉淀。
8．加入150 μl 70%乙醇，涡旋振荡5 sec，12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒弃上清。
9．重复操作步骤8。
10.将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5 min，确保沉淀在管中。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清，将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流。
11.空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5 min）。
  注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。但是要避免过分干燥DNA沉淀，因为过于干燥的DNA很难溶解。
12.加入200 μl缓冲液TB，低速涡旋5 sec，65℃加热10min-1h溶解DNA，其间轻弹数次助溶。
  注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA，孵育时间可能需要延长。

二、中量全血操作流程（1-10 ml血样；以5 ml血液处理量为例）
1．向5 ml含抗凝剂的血液中加入5 ml细胞裂解液CL，颠倒混匀5次，3,600rpm（~2,000×g )离心2 min，倒弃上清；
2．再向其中加入7.5 ml细胞裂解液CL，颠倒混匀5次，3,600rpm（~2,000×g )离心2 min，倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2 min，确保沉淀在管中（此步骤应小心操作，为避免沉淀被倒出，推荐使用尖底离心管）。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清，将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁上清的回流。
3．按照表1配制缓冲液FG与Proteinase K的混合液。
  注意：此混合液Z好现用现配，并在配好后1h之内用完。
4．加入2.5 ml缓冲液FG与Proteinase K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
  注意：当处理多个样品时，加入缓冲液FG和Proteinase K的混合液后要立刻涡旋混匀，不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀5 sec就足以混匀沉淀，但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀，此时可再次补加缓冲液FG和Proteinase K的混合液（具体补加量见表1），再次涡旋混匀。
5．65℃水浴10-30 min，其间颠倒混匀数次。
  注意：随着蛋白的消解，溶液的颜色从红色变为黄绿色。
6．加入2.5 ml异丙chún，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
  注意：与异丙chún完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该仔细观察。对于白细胞数目很少的样品，DNA沉淀可能看不到，此时应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全。
7．3,600rpm（~2,000×g )离心8 min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保沉淀在管中。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清。如果样品的白细胞数量足够多，可以看到白色的DNA沉淀。
8．加入2.5 ml 70%乙醇，涡旋振荡5 sec，3,600rpm（~2,000×g )离心3 min，倒弃上清。
9．重复操作步骤8。
10．将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5 min，确保沉淀在管中。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清，将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流。
11．空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5 min）。
  注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。但是要避免过分干燥DNA沉淀，因为过于干燥的DNA很难溶解。
12．加入500 μl缓冲液TB，低速涡旋5 sec，65℃加热1h溶解DNA，其间轻弹数次助溶。
  注意：如果DNA没有完全溶解，可室温振荡过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA，孵育时间可能需要延长。

三、大量全血操作流程（10-20ml血样；以10 ml血液处理量为例）
1．处理样品：
a.离心富集有核细胞进行核酸提取：将血样3,600rpm（~2,000×g )离心15-20 min，抽弃血浆，取中间白膜层细胞加入到15 ml离心管中，加入10 ml细胞裂解液CL，涡旋混匀10 sec，3,600rpm（~2,000×g )离心2 min，倒弃上清。再加入15 ml细胞裂解液CL，涡旋混匀10 sec，3,600rpm（~2,000×g )离心2 min，倒弃上清。
b.细胞裂解液CL处理血液标本分次富集有核细胞进行核酸提取：在15 ml离心管中添加细胞裂解液CL和血液样本（比例2.5:1），多次富集进行下游实验。
（例10 ml全血处理方式：在两个15 ml离心管中分别加入5 ml的全血和10 ml细胞裂解液CL,颠倒混匀5次，3,600rpm（~2,000×g )离心3 min，倒弃上清；再向其中加入2.5ml细胞裂解液CL，涡旋混匀10 sec，混合到一支离心管里，3,600rpm（~2,000×g )离心3 min，倒弃上清；进行下游操作。）
  注意：细胞裂解液CL处理步骤应小心操作，为避免沉淀被倒出，推荐使用尖底离心管。在极少的情况下细胞裂解液CL处理得到的沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清。
2．按照表1配置缓冲液FG与Proteinase K的混合液（比例100:1），对于10-20ml的全血标本，每个样品需要5 ml缓冲液FG与Proteinase K工作液。
  注意：此混合液Z好现用现配，并在配好后1h之内用完。
3．加入5 ml缓冲液FG与Proteinase K的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。
  注意：当处理多个样品时，加入缓冲液FG和Proteinase K的混合液后要立刻涡旋混匀，不要等所有的样品加完后再涡旋振荡。通常涡旋混匀30 sec就足以混匀沉淀，但是有可能痕量的胶状沉淀难以混匀，此时可再次补加1 ml缓冲液FG和Proteinase K的混合液，再次涡旋混匀。
4．65℃水浴30 min，其间颠倒混匀数次。
  注意：随着蛋白的消解，溶液的颜色从红色变为黄绿色。
5．加入5 ml异丙chún，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。
  注意：与异丙chún完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该仔细观察。应该至少颠倒离心管20次确保沉淀完全。
6．离心3,600rpm（~2,000×g )离心10min，倒弃上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保沉淀在管中。
  注意：如果得到的团块过于松弛，可以延长离心时间或者增大离心力。
7．加入5 ml 70%乙醇，涡旋振荡5 sec，离心3,600rpm（~2,000×g )离心3 min，倒弃上清。
8．重复操作步骤7。
  注意：如果得到的团块过于松弛，可以延长离心时间或者增大离心力。
9.将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5 min，确保沉淀在管中。
  注意：在极少的情况下沉淀可能会很松弛，所以要缓慢倒上清，将离心管倒置在吸水纸上是为了减少管壁中上清的回流。
10.空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5 min）。
  注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。但是要避免过分干燥DNA沉淀，因为过于干燥的DNA很难溶解。
11.加入1 ml缓冲液TB，低速涡旋5 sec，65℃加热1h溶解DNA，其间轻弹数次助溶。
  注意：如果DNA没有完全溶解，可室温振荡过夜。如果使用少量的缓冲液TB溶解DNA，孵育时间需要延长。

附表1：不同体积血液所需各种缓冲液用量（μl)

血液体积（μl)	100	300	1000	3000	5000	10000	20000
细胞裂解液CL（μl)	250	750	2500	7500	12500	25000	50000
缓冲液FG（μl)	50	150	500	1500	2500	5000	10000
Proteinase K（μl)	0.5	1.5	5	15	25	50	100
异丙chún（μl)	50	150	500	1500	2500	5000	10000
70%乙醇（μl)	50	150	500	1500	2500	5000	10000
缓冲液TB（μl)	100	200	200	300	500	1000	1000
补加缓冲液FG和 Proteinase K（μl)	10	30	100	300	500	1000	1000

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