DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)

特别提示：包括DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床YL及其他非科研用途！

产品名称：DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)
英文名称：Fragmentation/End repair/dA-tailing Reagent（Illumina)
产品货号：WH0208
产品规格：24次|96次

本制品是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的预混酶模块，包含了DNA片段化、末端修复以及3"端dA尾添加所需的所有酶类，可将双链DNA片段化为小片段，并分别在片段化DNA两端添加5"-P和3"端dA，所得产物无需纯化，可直接通过Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）用于adapter的连接。该模块采用一步法的反应流程，省去了多步纯化步骤，可对微量DNA样本进行GX、快速的片段化、末端修复及dA尾添加，操作更加简便，文库转化效率更高。

适用范围：用于双链DNA的片段化、末端修复及3"端添加dA，适用于illumina高通量测序平台DNA文库构建。
适用样本量：1ng~1μg DNA。

产品特点：
·单管酶促反应，一步完成双链DNA的片段化、末端修复、dA添加反应。
·高文库转化效率，DNA样本起始量可低至1ng。

产品组成：

组分	24次	96次
5×FEA Enzyme Mix	240μl	960 μl
10×FEA Reaction Buffer	120 μl	480 μl
FEA Enhance	120 μl	480 μl
Nuclease-Free ddH2O	1ml	4×1ml

保存条件：-25~-15℃保存，避免反复冻融，保质期为一年。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）
1．操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2．请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3．试验开始前，请清洁操作台，并使用RNA酶及DNA酶清除试剂，如RNase Away处理台面。确保没有RNA酶和DNA的污染。
4．进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5．试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。
6．由于使用本品所进行的片段化过程为酶促反应，故片段化过程对反应温度、反应时间、体系配制以及DNA上样量等因素较为敏感。强烈推荐用户按照本说明书所述步骤及优化的反应参数（如反应时间等）进行试验。

推荐使用的其他试剂：
1.Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）
2.NGS Library Amplification Reagent（WH0210-01/02）
3.Single-Index Adapter（Illumina)（WH0206-01/02/03）
4.BECKMAN Agencourt AMPure XP磁珠

操作步骤：

一、试验准备
1.在开始实验前，明确核酸的浓度及纯度至关重要，推荐上样量1ng~1μg DNA。DNA需溶解于以下溶液中：去离子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）等。
注意：
?确定上样DNA浓度至关重要，尤其在上样量低于100 ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。
?请确认DNA溶液中不含阳离子及螯合剂。如果DNA溶解于1×TE或不确定DNA溶液中的EDTA浓度，请参照附录Ⅰ所述步骤，使用BECKMAN公司的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化或参照附录Ⅲ进行片段化处理。
2.将各试剂置于冰上，5×FEA Enzyme Mix融化后用手指后轻弹混匀，不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。

二、试验步骤
1.照下表设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。

操作步骤	温度	时间
1	4℃	1min
2	32℃	3-24min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：确切的片段化反应时间需要根据DNA的实际上样量进行优化。下表1中列出10ng、100ng和1000ng上样量DNA片段化所需的时间，用户可以依据此时间进行调整。调整过程中，我们推荐额外设置一个反应时间延长3min以及一个缩短3min的对照。这样有助于确定切割至所需片段大小时所需要的准确反应时间。关于片段化时长的更多建议，请参考附录II。

表1：片段化时间选择表（32℃)

DNA主峰大小	250bp	350bp	450bp	550bp
10ng DNA上样量	24min	16min	14min	10min
100ng DNA上样量	16min	10min	8min	6min
1000ng DNA上样量	14min	8min	6min	4min

2.请按下表配制反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。

  当DNA上样量＞10 ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5 μl
DNA样本	X μl
Nuclease-Free ddH2O	（35-X) μl
总体积	40 μl

  当DNA上样量≤10 ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5 μl
DNA样本	X μl
FEA Enhancer	2.5 μl
Nuclease-Free ddH2O	（32.5-X) μl
总体积	40 μl

  注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免因溶液转移过程中挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。
3.取1个新的200 μl薄壁管置冰上，向管中加入10 μl 5×FEA enzyme Mix，随后将（2）中反应体系转移40 μl至同一薄壁管中，轻柔吸打混匀6-8次。
4.瞬时离心薄壁管，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
5.当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。
6.立即进入接头连接步骤，为保证连接效率，推荐使用Fast Ligation Reagent（WH0201-01/02）。

附录I：DNA样品溶液中二价盐离子以及EDTA的去除
请参照供应商提供的步骤进行纯化。
1.若DNA溶液体积小于50 μl，请用无核酸酶的去离子水补足体积至50 μl。
2.加入90 μl（1.8倍体积）完全涡旋混匀的Agencourt AMPure XP磁珠至DNA溶液中，吸打混匀。若DNA溶液体积大于50 μl，请根据DNA溶液的实际体积，加入1.8倍体积完全涡旋混匀的Agencourt AMPure XP磁珠。
3.室温孵育5 min后，将反应管置于磁力架上2~4 min收集磁珠，小心去除上清液。
4.用200 μl 80%乙醇洗涤磁珠，将反应管置于磁力架上收集磁珠，弃去上清。重复此洗涤步骤一次。
5.将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置10 min或至磁珠干燥为止。
6.加入45 μl 10mM Tris-HCl（pH8.0）使磁珠完全悬浮后，置磁力架上2 min。待磁珠贴壁后小心转移42.5 μl上清至新的离心管。
7.使用Quibit、Picogreen或其他荧光定量方法测定纯化后的DNA浓度。

附录II：优化片段化处理时间
片段化反应时间需要根据DNA上样量进行优化，参考图1所示曲线选择反应时间。优化过程请使用将实际用于测序的DNA样品，这将有助于在测序时保证片段化过程的可重复性。初次优化时，我们推荐添加2个额外的反应时间，即依据图中曲线选择反应时间后，在此时间基础上分别延长和缩短3min。若对片段大小有较精确的要求，可在此基础上继续对反应时间进行微调。在实际操作中，若DNA上样量≥10 ng，用户可在片段化步骤完成后即对反应效果进行评价。具体方法为使用1.8倍体积AMPure@XP磁珠对反应产物进行纯化，并将其溶解于10 μl Tris溶液或去离子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity试剂盒确定片段分布。
对于上样量＜10 ng的片段化反应，为了节省反应时间，我们推荐在每个反应体系中（50 μl）添加2.5 μl的FEA Enhancer。反应时间则推荐使用图1中将10 ng DNA切割至特定片段大小所需时间的一半。例如：若期望DNA片段集中于350 bp，则加入FEA Enhancer后反应10 min左右即可。

图1不同DNA上样量经片段化后产出片段大小与反应时间对应曲线

附录III：1×TE溶液中DNA的片段化/末端修复/A尾添加
当DNA溶解于1×TE溶液中时，请参照以下步骤进行DNA的片段化/末端修复/A尾添加反应。
1．按照下表设置PCR仪反应程序。请确认在反应中开启热盖。如有可能，请将热盖温度设置为70℃。DNA上样量为1-1000ng。

反应步骤	反应温度	反应时间
1	4℃	1min
2	32℃	5-35min*
3	65℃	30min
4	4℃	保持

*注：反应时间需根据DNA的实际上样量进行优化。若DNA上样量≥10 ng，反应体系中加入2.5 μl FEA Enhancer，推荐使用25 min作为起始反应时间，此时产生的片段主要集中于300-500 bp；若DNA上样量＜10 ng，反应体系中加入5 μl FEA Enhancer，则推荐使用15 min作为起始时间，此时片段集中于300 bp。若需要进行调整，则请以3min为单位，在原反应时间基础上进行增减，直至得到所需要的片段大小。

2．为了保证良好的试验效果，请严格按照以下说明进行操作。在一个新的薄壁管中参照下表配制反应体系，此步请于冰上操作，配置好的反应体系经轻柔吸打混匀，注意不要涡旋震荡。

  当DNA上样量≥10ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5μl
DNA样本	X μl
FEA Enhancer	2.5μl
Nuclease-Free ddH2O	（32.5-X) μl
总体积	40μl

  当DNA上样量＜10ng

成分	用量
10×FEA Reaction Buffer	5μl
DNA溶液	X μl
FEA Enhancer	5μl
Nuclease-Free ddH2O	（30-X) μl
总体积	40μl

1．取新的PCR薄壁管置冰上，加入10 μl 5×FEA Enzyme Mix。随后将上一步准备好的反应体系转移40 μl至同一薄壁管中。轻柔吸打混匀6-8次。注意操作过程中请保持反应管置于冰上。
2．将薄壁管瞬时离心后，立刻转移至已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
3．当反应程序结束，PCR仪温度降至4℃后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。立即进入接头连接步骤，为保证连接效率，推荐使用Fast Ligation Reagent（WH0209-01/02）。

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