禽传染性支气管炎病毒荷兰株探针法荧光定量RT-PCR试剂盒_详细资料

产品信息

货号： KL15-86680 供应商：上海康朗生物科技有限公司数量： 30 保质期：有效期一年保存条件： ‘-20℃保存规格： 50次

PCR使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
2. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的 DNA 释放剂SY装。则按下面步骤操作：
3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足够 10 个样品）为例：在一干净塑料
管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超纯水，充分混合均匀即可。溶液 A 工作液可室温放置，但Z好在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足够 10 个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液 A 工作液的体积需要做相应的调整。
4. 在标记好的 N+2 个离心管中，加入 1-5mg 固体样品（半粒芝麻大小，如奶酪）或5uL 液体样品（如牛奶）待测样品。在样品制备阳性对照中加入 5uL 阳性对照，在样品制备阴性对照中加入 5uL 水。
5. 在每个管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。
6. 95℃保温 10 分钟。
7. 待冷却到常温后加入 10uL 溶液 B 并混匀得 DNA 释放液。每个样品得到的 DNA释放液足够进行 50-100 次 PCR。

二、设置 PCR 反应（40 uL 体系）
8. 在 N+2 个 PCR 管中加入下列成分，下面以样品数为 1 举例（注意：如果次使用DNA 释放剂，Z好每个样品设置两个模板用量的 PCR 反应，两个反应的模板使用量差 10 倍，由此确定用量，以后就用效果好的那个模板用量）：

成份样品（用量1）样品（用量2）阳性对照阴性对照

即用型 PCR Mix 3.0 20 uL 20 uL 20 uL 20 uL

PCR 引物混合液 2 uL 2 uL 2 uL 2 uL

制备的样品 18 uL 2 uL 无无

样品制备阳性对照不加不加 2 uL 不加

样品制备阴性对照不加不加不加 2 uL

超纯水不加 16 uL 16 uL 16 uL

9. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行 PCR。

过程温度时间

预变性 94℃ 10分钟

PCR 反应
（35 个循环） 94℃ 45s

56℃ 45s

72℃ 45s

延伸 72℃ 5分

10. 电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix 在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。预期的 PCR 产物长度为 121bp。阳性对照必须有此条带出现，阴性对照必须无任何扩增
温馨提示：不可用于临床ZL。

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成份	样品（用量1）	样品（用量2）	阳性对照	阴性对照
即用型 PCR Mix 3.0	20 uL	20 uL	20 uL	20 uL
PCR 引物混合液	2 uL	2 uL	2 uL	2 uL
制备的样品	18 uL	2 uL	无	无
样品制备阳性对照	不加	不加	2 uL	不加
样品制备阴性对照	不加	不加	不加	2 uL
超纯水	不加	16 uL	16 uL	16 uL

过程	温度	时间
预变性	94℃	10分钟
PCR 反应（35 个循环）	94℃	45s
	56℃	45s
	72℃	45s
延伸	72℃	5分