特别提示:包括一步法RT-qPCR试剂盒(探针法)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床YL及其他非科研用途!
产品名称:一步法RT-qPCR试剂盒(探针法)
英文名称:QuickKing One Step RT-qPCR Kit(Probe)
产品货号:WH0111
产品规格:50μl×50次|50μl×200次
本试剂盒是采用探针法(TaqMan,Molecular Beacon等)进行一步法RT-qPCR的专用试剂。使用本制品进行Real Time One Step RT-qPCR反应可在同一反应管内连续进行,操作简单,避免了样品间交叉污染的同时也提高了检测的灵敏度。
本试剂盒中的25×QuickKing Enzyme Mix为我司新型逆转录酶(King RTase)、新型抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶及RNase Inhibitor的预混Mix形式,其中的King RTase是分子改造后的新型逆转录酶,特别增加了疏水motif,具有更强的RNA亲和性和热稳定性,提高了该酶的逆转录效率和对具有复杂二级结构RNA模板的延伸能力;PCR过程中采用了性能优良的新型热启动Taq DNA聚合酶,使得逆转录后的PCR反应具更高的扩增效率和特异性。另外,本产品中的2×QuickKing One Step Probe RT-qPCR Master Mix是专门为上述两种关键酶而优化的新型反应体系,其中包含必要离子组分、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂,可保证King RTase和新型热启动Taq DNA聚合酶在整个一步法反应过程中发挥zuì大功效。
本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对多种高低丰度的靶基因进行准确定量检测,重复性好,可信度高。RT-qPCR技术可用于检测样本中目的基因表达水平及RNA病毒的含量。
产品特点:
·反应灵敏GX:性能优良的逆转录酶和Taq酶保证了极高的反应效率;
·操作简单快速:双组分的产品形式使得操作过程变得简单快速;
·解决复杂模板:通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板;
·样品普适性好:对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高。
试剂盒组成: 组分 | 50μl×50次 | 50μl×200次 |
2×RT-qPCR MasterMix | 1.25ml | 4×1.25ml |
25×QuickKing Enzyme Mix | 100μl | 400 μl |
50×ROX Reference Dye | 250μl | 1ml |
RNase-Free ddH2O | 2×1ml | 5×1ml |
储存条件:-20℃保存,保质期1年。
适用的Real Time PCR扩增仪:PRISM 7000/7700/7900HT,7300/7500 Real-Time PCR System,7500 Fast RealTime PCR System,Viia 7 (Applied Biosystems)
OPTICONTM/CFX96 (BIORAD)
Light Cycler 480 (Roche)
Smart Cycler® System (Cepheid)
Mx3000P/Mx3005P (Stratagene)
其他各种Real Time PCR扩增仪
注意事项:1.RNA模板可以采用总RNA或mRNA,建议使用我公司的RNA提取试剂盒制备高质量的总RNA。
2.一步法RT-qPCR实验应避免RNase污染,可采用以下措施:
①因人的皮肤表面和唾液都有RNase,因此实验中应佩戴一次性手套和口罩;
②一步法RT-qPCR实验应使用专门的仪器和耗材,建议在专门区域操作RNA;
③一步法RT-qPCR实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二*酯)水溶液在37℃处理12h,并高压灭菌30min后使用。
3.25×QuickKing Enzyme Mix在取用之前应短暂离心收集溶液后再吸取,吸取时动做要慢,使用后应尽快放回-20℃。
4.2×QuickKing One Step Probe RT-qPCR Master Mix在取用前应充分混匀并离心后使用。
5.本试剂盒必须使用特异性引物,引物可根据具体实验来选择。
操作步骤:
1.完全融化模板RNA,特异性引物,2×RT-qPCR MasterMix、50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O,短暂离心后置于冰浴上。
2.按下表在冰浴条件下配制反应液(50μl体系):
成分 | 使用量 |
2× RT-qPCR MasterMix | 25 μl |
25×QuickKing Enzyme Mix | 2 μl |
上游特异性引物(10μM) | 1.25 μl① |
下游特异性引物(10μM) | 1.25 μl① |
探针(10μM) | 1.0 μl② |
RNA模板 | 10pg-1μg total RNA |
50×ROX Reference Dye③ | 跟据不同仪器添加 |
RNase-Free ddH2O | 补水至50 μl |
①引物终浓度为0.25 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时,可增加PCR反应体系中的引物浓度;发生非特异扩增时,可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的,可以在0.05-0.90 μM范围内调整。
②探针的浓度与使用的Real-Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关,实际使用时请参照仪器说明书,或各荧光探针的具体使用说明进行。通常探针终浓度为0.20 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。需要进一步优化探针浓度的,可以在0.10-0.50 μM范围内调整。
③几种常见仪器的zuì适ROX Reference Dye浓度如下:
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等:5×(例如:5μl ROX/50μl体系);
ABI 7500、7500 Fast、Viia 7;Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等:1×(例如:1μl ROX/50μl体系);
Roche仪器,Bio-Rad仪器,Eppendorf仪器等:不用添加。
3.进行Real Time One Step RT-qPCR反应
PCR反应管请用离心机瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的标准PCR反应程序,如果使用该程序得不到良好的实验结果时,再进行PCR条件的优化。反应步骤(建议)如下:
反应温度 | 反应时间 | 反应循环数 | 说明 |
50℃ | 30min | 1 | 逆转录 |
95℃ | 3min | 1 | 预变性 |
95℃ | 15sec | 40 | PCR循环步骤, 请在该步骤收集荧光 |
60℃ | 30sec |
4.实验结果分析
反应结束后确认Real Time One Step RT-qPCR的扩增曲线、CT值、标准曲线等,并进行RT-qPCR定量结果分析。
除了一步法RT-qPCR试剂盒(探针法),,我公司还供应以下相关产品:
货号 | 名称 | 规格 |
BTN80205 | DMSO,PCR级 | 1.5mL |
BTN131178 | DNA Shuffling试剂盒 | 10次 |
WE0106 | 2×BAmp MasterMix(含染料) | 5ml |
WE0111 | BaldStar Taq DNA Polymerase | 500U|2500U |
WE0159 | dNTP混合溶液(10 mM) | 1ml|5ml |
ALH266 | 反转录试剂盒 | 50次|100次 |
RFT107 | RNaseYZ剂 | 2000U|5×2000U |
SY0294 | 耐热逆转录酶II | 2000U |
JN0010 | T7 RNA聚合酶 | 5000U |
JN0040 | 2×Fast Taq PCR MasterMix | 1ml×5 |
QN0955 | 通用引物 ITS2 | 250μl(10uM) |
HQF12 | 植物免抽提直接PCR试剂盒 | 100次/500次/1000次 |
BTN180701 | 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
MT0051 | 超高保真DNA聚合酶 | 100U|1000U |
GL1303 | 明胶水溶液(2%,PCR级) | 50ml |
WH0007 | 血液样本直接PCR试剂盒 | 100次|500次 |
WH0068 | Pfu DNA聚合酶 | 250U|500U |
WH0085 | 超纯dATP溶液(100mM) | 0.5ml |
WH0125 | lncRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green) | 20μl×125次|20μl×500次 |
温馨提示:不可用于临床ZL。