甲苯·胺蓝（TB）染色

 一、甲苯·胺蓝（TB）染色简介
甲苯·胺蓝（Toluidine blue，TB）是常用的人工合成染料的一种，属于醌亚胺染料类，这类染料一般含有两个发色团，一个是胺基，一个是醌型苯环，来构成色原显色。染料除有发色团外，还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类，帮助发色团对组织产生染色力， 使切片上的组织细胞着色。甲苯·胺蓝不仅含有两个发色团，还含有两个助色团，为碱性染料，甲苯·胺蓝中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。

二、染色步骤（软骨组织为例）
1、常规脱钙，包埋、固定。 
2、石蜡切片入二甲苯2次。 
3、系列乙醇各1min自来水洗。 
4、入软骨染色液浸染。根据不同组织，染色时间不完全相同。 
5、自来水洗2min，滤纸吸干水分。
6、acetone分化至软骨细胞呈紫蓝色清楚可见。 
7、逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
8、结果：软骨、成骨细胞呈紫红色；背景呈淡蓝色
 
三、样本说明
1、石蜡切片
取材：1、组织离体后需及时固定；2、组织标本不宜过大、过厚。
固定：1、固定液：10%（4%Paraformaldehyde）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量与组织体积比为10:1～20:1；3、固定：适宜的固定时间，主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
保存：切片经60℃烤片3-5小时后，可于常温或4℃干燥保存。
 
2、冰冻切片
取材：取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。
固定：样本冰冻切片后，应立即放入甲醇、acetone、95%酒精、4%Paraformaldehyde等固定液中固定。
保存：固定好的切片自然风干，密封后置于-80℃、-20℃保存，尽快用于后续实验。
 
3、细胞块石蜡切片
细胞量较多的样品，可离心分离所需细胞，用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块，然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。
 
4、细胞爬片
在孔板里做的细胞爬片，爬片取出后，用PBS洗涤2次（根据研究目的，PBS洗涤可选择不做），用4%Paraformaldehyde4℃固定15分钟，将表面液体吹干，置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段时间。
 
5、细胞涂片细胞涂片常用的固定液有95%酒精（Z为常用）、酒精-Glacial acetic acid solution、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 
 
四、注意事项
1、常用的固定液为中性甲醛和4%Paraformaldehyde，能使大多数抗原保存良好，适用于免疫组织化学。
2、病理实验切片Z好是防脱片，以免实验过程中出现掉片。若客户提供切片，应告知切片有无防脱处理。
3、骨组织、皮肤组织或脂肪含量较高的样本，实验过程中有较高的掉片几率。
4、客户可提供组织块（以10%、4%Paraformaldehyde或10%中性甲醛固定，如组织块极小请事先说明）、蜡块或切片（使用免疫组化专用切片，以避免实验过程中掉片）
5、待检测蛋白的种属、实验分组情况及实验背景资料、其他具体要求等需事先说明。
6、若客户提供骨组织或钙化程度较高的组织进行实验，需进行脱钙处理。
7、浸泡在固定液中的组织样本，在运输中容器需密封，防止破碎、渗漏。

更多免疫荧光实验问题，请咨询嘉美实验。