microRNA测序实验外包服务

【嘉美实验】microRNA是一类大小为21-23nt的非编码小RNA分子，通过沉默或降解其靶点mRNA分子调控基因表达。大量研究表明，microRNA在正常发育过程以及疾病发生过程中具有重要的作用，在诊断和ZL领域具有光明的应用前景。然而目前研究microRNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术，这些方法主要关注microRNA的表达与定量，并仅局限于研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的microRNA，无法寻找和发现新的microRNA分子。

基于Illumina高通量测序平台的microRNA测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，不但可以检测microRNA表达差异，而且可以研究microRNA的3’异质性，众多的isomiR（microRNA异构体），以及未发现的新的microRNA，为更加灵活、深入研究microRNA提供解决方案。
 
嘉美实验为您提供microRNA测序技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，嘉美的技术服务人员就可为您完成全部实验操作，包括RNA抽提、小RNA文库构建和纯化、高通量测序和数据分析、并提供完整的实验报告。
 
microRNA测序实验优势
1、适用于所有物种的microRNA表达谱分析——无需预知microRNA的序列和二级结构信息
2、全基因组范围的表达谱分析——涵盖了任意长度的，已知和未知的microRNA
3、数字化信号——测序直接获得序列，可鉴别序列间单个碱基的差异，识别microRNA变体
4、检测范围宽——跨越5个数量级的宽检测阈值，从几个到数十万个拷贝精确计数
5、灵敏度高——每个独立的测序通道可以检测多达1000万转录组分子序列，提供了极大的数据深度与覆盖率，能够检测丰度极低的，以及稀少的microRNA
6、数据质量高——microRNA测序具有极大的测序通量，灵敏度与精确性，同时其产生的定量数据与实时定量PCR结果具有很高的一致性
7、 生物信息分析更丰富——能够随时使用的microRNA数据库注释原始数据中已知的microRNA，还能够进一步发掘未匹配数据，发现新的microRNA种类及异构体，寻找更深入的研究信息
 
microRNA测序特点
1、 一站式解决方案
嘉美实验为您提供microRNA高通量测序全程技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞样本，嘉美的测序技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。
2、适合样品量少的客户
嘉美对测序实验经过优化，从总RNA开始实验，不需要对MicroRNA进行富集和反复的纯化，因此对于样品量少的客户更加适合， 1ug就可以进行实验。
3、节省实验的步骤，减少实验误差
传统方法是先对microRNA进行富集，再两边加接头，而且每一步都要纯化回收，很容易产生实验误差，而我们只需要对总RNA就能完成实验，减少实验误差。
4、 深入的数据分析
嘉美实验拥有强大的生物信息学团队，能够根据不同客户的要求进行标准和深入的数据分析，提供能直接用于文章发表的图表和数据。
 
基本数据分析结果展示
1、测序数据统计

Sample Name	Clean Reads*	Adaptor Trimmed**	microRNA Reads***
Z381-FCort	7,237,456	7,000,106	5,906,193
Z381-PCort	7,483,217	7,199,637	5,743,606

*图释：*: 通过Illumina质控的高质量read的数目;**：去掉接头序列后长度大于或等于15nt的read数目;***：能够与版miRBase数据库中的pre-microRNA序列匹配（Z多允许一个碱基的错配）的read数目
 
2、microRNA表达谱数据
microRNA测序Z常见的用途就是对不同样品中microRNA的表达进行定量分析和比较。但是由于原始read数与测序数据量相关，直接用原始read值衡量特定microRNA的表达是不合适的。因此，我们对microRNA的表达量进行了标准化：将原始的read值转化为TPM（在每兆可与miRBase数据库中的pre-microRNA匹配的reads中，特定microRNA转录本所占的read数目）。TPM值可以用于衡量特定microRNA在样品中的表达丰度，以及对不同样品间差异表达的microRNA的分析。
 
*图释：microRNA表达谱数据示例
 
3、microRNA差异表达数据
根据标准化后的microRNA表达值（TPM），我们会计算出每个microRNA在不同样品间（如处理组 vs 对照组）的表达变化（fold change），并通过ttest计算样品间microRNA表达量变化的统计学显著性。那些表达变化倍数在1.5倍以上，p值小于0.05的microRNA被挑选出来，并定义为显著性差异表达的microRNA。针对多重比较，p值被校正为FDR。客户可以根据倍数变化，p值，FDR等参数对差异表达的microRNA进行排序和筛选。
 
*图释：样品间差异表达的microRNA数据示例
 
4、差异表达microRNA的聚类图
层次聚类是一种Z常见的用于分析表达数据的聚类方法。它可以根据样品中基因的表达水平将样品自动的分组，可以让客户从整体上评估样品间的基因表达差异，以及样品间的关系。左侧的树状图可以反映样品间基因表达模式的关系。
 
*图释：不同样品组之间差异表达microRNA的聚类示例
 
5、差异表达microRNA的火山图
火山图可以对不同样品组之间差异表达的microRNA进行图形化的展示。横轴代表处理组和对照组之间microRNA表达倍数的变化（log2转化），纵轴代表相应的p值（-log10转化）。火山图可以直观的展示microRNA在样品组间的倍数变化与相应的统计学显著性之间的关系（图5）。纵向的绿线分别对应1.5倍的上调（右侧）和下调（左侧），绿色平行线对应0.05的p值。下面火山图中的红色点代表在不同样品组中具有统计学显著性的差异microRNA。
 
*图释：火山图示例
 
6、新的microRNA预测
通过microRNA测序可以预测新的microRNA。新microRNA能通过miRDeep软件进行预测。根据microRNA成熟过程中，dicer酶对microRNA前体的加工原理，miRDeep构建了一种简单的预测模型。通过这个模型，它可以根据高通量测序结果准确的预测样品中的新microRNA。
 
*图释：通过miRDeep预测出的新microRNA示例
 
 
microRNA测序实验服务流程
 

1、样品RNA准备
2、测序文库构建
PAGE胶纯化特定大小的microRNA分子
连接5’RNA接头
连接3’RNA接头
逆转录反应获得cDNA测序文库
高保真聚合酶扩增构建的测序文库
3、DNA成簇（Cluster）扩增
4、高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）
5、数据分析
原始数据读取
使用公用microRNA数据库注释已知microRNA
深层次数据分析
6、提供实验报告
原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估
基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等
高级数据分析（应客户要求定制），如使用已知数据库注释已知microRNA及分析不同样本间表达水平差异，使用已知数据库鉴别rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA并预测新的microRNA，预测microRNA的靶点基因。
 
案例分析-microRNA-seq
案例1：通过microRNA测序发现了与ATM基因缺陷型乳腺上皮细胞的癌症易感性相关的microRNA表达谱特征(Genome-Wide Small RNA Sequencing and Gene Expression Analysis Reveals a microRNA Profile of Cancer Susceptibility in ATM-Deficient Human Mammary Epithelial Cells. 2013, PLOS ONE)
通过small RNA测序，研究者发现了81个microRNA，其表达变化与ATM基因缺陷有关。接下来，通过生物信息学分析预测了microRNA的靶基因。同时采用了表达谱芯片检测靶基因的表达变化，发现microRNA调控的靶基因，包括癌基因MAF和CEPBA，肿瘤YZ基因SOCS1等。结合microRNA和靶基因mRNA的分析结果，提示microRNA在肿瘤形成和发展中发挥重要的作用。本研究采用乳腺上皮细胞（WT）和ATM缺陷的乳腺上皮细胞，模拟了从正常细胞向癌变乳腺上皮细胞转化的过程，提示microRNA在肿瘤早期发挥作用，为未来肿瘤早期诊断标记物筛选，预后标志物筛选，早期干预ZL方法开发等的研究奠定了基础。
 
技术路线

结果展示

*图释：microRNA测序的基本结果
 
 
*图释：筛选差异表达的microRNA。筛选标准为p≤0.05; Fold Change在1.5倍以上


*图释：在ATM缺陷型和野生型乳腺上皮细胞间差异表达的microRNA。图中每个点代表一个microRNA，Y轴表示microRNA在ATM缺陷型细胞与在野生型细胞中的表达比值，X轴表示每个microRNA的平均表达值（TPM，log2转化）。显著性差异表达的microRNA（倍数变化大于1.5，p值小于0.05）用蓝点表示。
 
 
*图释：microRNA靶基因的GO分析。
 
案例2.  通过血清中特定microRNA的表达特征预测非小细胞肺癌患者生存期长短（Serum microRNA signatures identified in a genome-wide serum microRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cance）
作者通过microRNA高通量测序对两组生存期不同的非小细胞肺癌患者的血清样品进行检测，发现了11个差异表达的microRNA。通过实时定量PCR进一步验证，找出了4个与生存期长短相关的microRNA。通过生物信息学方法，根据这4个microRNA在训练样品组中的表达情况构建了一个预测模型。通过这个模型，只要检测血清中这4个microRNA的表达值，就可以算出特定患者的风险值，从而预测其生存期的长度。，通过验证样品组，对预测模型的准确性进行进一步的验证。
 
技术路线

 
结果展示

*图释： 303个早期非小细胞肺癌患者的风险值分析。（A）风险值分布；（B）患者的生存状况和生存时间；（C）4个关键microRNA在非小细胞癌患者中的表达情况。

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