cDNA链合成试剂盒 核酸扩增(PCR)

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、YL及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖cDNA链合成试剂盒 核酸扩增(PCR)在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：cDNA链合成试剂盒 核酸扩增(PCR)
规格：100次
品Pai：百奥莱博
英文名：BalbScript cDNA Synthesis Kit
编号：WE0132
  本试剂盒是专为两步法RT-PCR步实验配制的cDNA链合成试剂盒。该试剂盒中使用的BalbScript逆转录酶是M-MLV由来的新型GX逆转录酶，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性，cDNA链合成的效率和产量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA链。点突变消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。精心优化的RT Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。该试剂盒配备所有逆转录试剂，使用简单方便。适用于链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR，以及全长cDNA文库的构建等。

试剂盒组成：

 

组份	100次
BalbScript，200 U/μl	25μl
5×RT Buffer	120μl
Primer Mix	60μl
dNTP Mix，2.5 mM Each	120μl
DTT，0.1 M	60μl
RNase-Free Water	1ml

产品特点
1、GX的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。
2、良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。
3、灵敏度高：可利用pg级的总RNA或mRNA模板合成cDNA链。
4、使用方便：逆转录试剂盒中已配备所有逆转录试剂，仅需准备模板即可轻松完成逆转录。

注意事项：
1、在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2、实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3、本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4、若起始RNA的量小于50ng，建议加入RNA酶YZ剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。

操作步骤：
注意：1ng-5μg总RNA可建立20μl反应体系，如果总RNA量大于5μg，请按比例扩大反应体系。

I．逆转录操作步骤：
1、将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、BalbScript和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
2、根据以下表格配制反应体系，总体积为20μl。
 

试剂	20μl反应体系	终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each	4μl	500μM Each
Primer Mix	2μl
RNA Template	Xμl	50 pg-5μg
5×RT Buffer	4μl	1×
DTT，0.1 M	2μl	10 mM
BalbScript，200 U /μl	1μl
RNase-Free Water	up to 20μl

注意：
1)若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶YZ剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。
2)Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。

3、涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4、cDNA合成反应条件：
1)若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。
2)若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。
注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50℃，增强逆转录效率。
5、反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
6、逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

II．若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤：
1、将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、BalbScript和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
2、根据以下表格配制反应体系，总体积为13μl 。
 

试剂	20μl反应体系	终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each	4μl	500μM Each
Primer Mix	2μl
RNA Template	Xμl	50 pg-5μg
RNase-Free Water	up to 13μl

3、70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
4、短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5、继续向以上反应液中加入以下试剂：
 

试剂	20μl反应体系	终浓度
5×RT Buffer	4μl	1×
DTT，0.1 M	2μl	10 mM
BalbScript(200 U/μl)	1μl

注意：
1)若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶YZ剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。
2)Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成。

6、进行cDNA链合成：
1)若下游进行荧光定量PCR检测，50℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。
2)若下游进行普通PCR检测，50℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。
7、反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
8、逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量应小于PCR反应体系的1/10，或置于-20℃长期保存。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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·结核分枝杆菌基因分型试剂盒(VNTR-9)
编号：WE0118
英文名称：TB Typing Kit(VNTR-9)
规格：50次
  本试剂盒是以分子流行病学研究进展为基础，经工艺优化后形成的人型结核分枝杆菌基因分型产品。本产品利用结核分枝杆菌基因组中可变数目串联重复序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多态性进行基因型分型区分临床菌株，是研究结核分枝杆菌分子流行病学和监测结核病传播状况的有力工具。与现有其它基于VNTR原理的结核分枝杆菌VNTR分型系统相比，这一分型系统对ZG流行的菌株具有更强的分辨能力，因此特别适合于ZG用户的需求。

  通过对各PCR反应引物序列和预混反应液成份进行精心优化，使得本产品具有很强的抗干扰力。与用户自配试剂相比，本产品显著提升了特异条带信号强度，降低了使用粗制模板(煮沸菌液)时非特异条带的出现率，使实验操作更加简便、快捷的同时，提高了检测成功率。本产品的预混反应液化学稳定性良好，能有效抵抗反复冻融(10次)和较长时间(一周)的室温环境，更好地适应了用户检测工作中的灵活性需求。

  本产品将人型结核分枝杆菌(MTBC)鉴定、非结核分枝杆菌(MOTT)及模板质量鉴定、结核分枝杆菌北京家族菌株鉴定，和后续的9位点VNTR分型鉴定整合在一个试剂盒中，使用户仅需一个试剂盒、12个PCR反应即可获得待测菌株基因型鉴定所需的完整信息。检测的分辨力指数(Hunter-Gaston index，HGI)可达0.989 。并且，基因型鉴定结果可数字化记录，使得不同样本批次，不同地区，不同时间，不同研究者之间的实验数据可以很方便地进行比对和汇集分析，极大地提高了数据的使用效率。

  对鉴定为VNTR-9基因型成簇(所有9个位点具有相同重复数)的样本，若要判定菌株间是否存在近期传播关系，需使用配套产品TB基因分型试剂盒HV-3(货号WE0119)，做进一步的分型鉴定。VNTR-9与HV-3两个产品的结合使用可将检测的HGI提升至0.993 。关于TB基因分型试剂盒HV-3(货号WE0119)产品的更多信息请见其产品说明书。


cDNA链合成试剂盒 核酸扩增(PCR)关键词：cDNA链合成试剂盒,BalbScript cDNA Synthesis Kit,WE0132


·dNTP混合溶液(10 mM)
编号：WE0159
英文名称：dNTP Mix(1mM each)
规格：1ml|5ml
  本产品为高质量的脱氧核苷酸(dNTP)的混合物，包括等摩尔的dATP、dGTP、dCTP、dTTP。经过PCR检测的脱氧核苷酸，可与所有的耐热聚合酶配套使用。其中高纯dNTP纯度均达到99%以上，超纯dNTP纯度均达到99.9%以上，不含DNase和RNase。

使用方法：
dNTP(10 mM each)可直接使用，或用调节至中性(PH7.5 左右)的无菌超纯水稀释至适当浓度使用。可用于PCR反应、Real-time PCR、DNA序列测定、分子标记、cDNA合成等。

储存条件：-20℃。

·GST琼脂糖凝胶
编号：WE0269
英文名称：Glutathione-Sepharose Resin
规格：10ml
  本产品为基于三甘醇(16原子间隔臂)的谷胱甘肽琼脂糖，可快速、温和、特异性地纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶等，尤其适用于在大肠杆菌、昆虫细胞和哺育动物细胞中表达的GST融合表达蛋白。该填料具有很好的物理和化学稳定性，使用寿命长，使用方便，批次重复性好，可一步分离得到纯度较高的目标蛋白，纯化条件温和，可保证蛋白的活性。

支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：5-10 mg GST标签蛋白/ml 填料
粒径：50-160μM

注意事项：
1、请勿将 GST琼脂糖凝胶冷冻、干燥和离心，整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
2、蛋白层析应使用高纯度的试剂和水，层析前缓冲液应用0.45μM滤膜过滤后使用。另外为防止柱子阻塞，上柱前建议将裂解液进行离心，或者使用0.45μM滤膜过滤。
3、GST 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得结合量，上样流速建议为：0.2-1ml/min(6ml层析柱)，0.5-2ml/min(12ml层析柱)。对于吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇 2-4小时，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作，另外在细菌抽提试剂中添加5 mM DTT，可以显著提高GST标签结合能力。
4、不同的 GST 融合蛋白取得纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行 SDS-PAGE 以及 Western 杂交分析，以确定纯化条件。
5、GST 融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。建议优化蛋白表达条件尽量使蛋白可溶性表达。
6、如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。

使用方法：

I 缓冲液的准备
1、结合缓冲液(PBS)：10 mMNa2HPO4，1.8 mMKH2PO4，140 mMNaCl，2.7 mMKCl，pH7.4
2、洗脱缓冲液：10 mMNa2HPO4，1.8 mMKH2PO4，140 mMNaCl，2.7 mMKCl，10 mM还原型谷胱甘肽(GSH)，pH7.4。将0.1 g还原型谷胱甘肽(GSH)溶于30ml 结合缓冲液，或将0.25 g溶于75ml结合缓冲液中。
3、再生缓冲液1：0.1 MTris-HCl，0.5 MNaCl，0.1% SDS，pH8.5
4、再生缓冲液2：0.1 M Sodiumacetate，0.5 MNaCl，0.1% SDS，pH4.5

II 样本制备
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加1-5ml细菌蛋白抽提试剂(每1ml细菌蛋白抽提试剂中加入10μl蛋白酶YZ剂混合物)，如有需要可以超声裂解菌体。
注意：
1)当提取物粘度高时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μlDNase I(1000U/ml)，2μl Lysozyme(50 mg/ml)，DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(WE0214)、 DNase I(WE0213A)，或直接从我公司购买WE0261细菌蛋白抽提试剂盒，包含细菌蛋白抽提试剂、DNase I、Lysozyme和蛋白酶YZ剂混合物。
2)超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致溶液过热，可分成短时间，多次超声，以菌液变清即可。
2、10000rpm，4℃离心15分钟，将上清转移至新的已预冷的离心管中，然后用预冷的PBS Buffer重悬沉淀(每50ml裂解液的沉淀加入3ml PBS)。
3、分别取10μl上清和沉淀悬液进行SDS-PAGE电泳检测，以确定蛋白存在于上清或沉淀中。若目的GST融合蛋白形成包涵体(不可溶蛋白)，应在纯化以前以适当的方式进行溶解和重折叠。

III 组装层析柱
1、将Glutathione-Sepharose Resin混合均匀直至重悬，用吸管移取适量的填料至层析柱中。室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护液，将填料与乙醇一起混匀，以每ml填料纯化5-10 mg GST标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇混合液加入层析柱中。
2)如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2、加入5倍柱体积的去离子水洗涤，再用10倍柱体积的结合缓冲液平衡，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

Ⅳ GST融合蛋白的纯化
1、将层析柱的出口连接上紫外蛋白监测仪，根据紫外蛋白监测仪观察280 nm处的吸收值来监控层析柱流出蛋白情况。
2、上样：将制备的蛋白样品用结合缓冲液等体积稀释后，加入到已平衡好的层析柱中，建议上样流速为： 0.5-1ml/min(6ml层析柱)，1-2ml/min(12ml层析柱)。观察280 nm吸收情况并收集流穿蛋白。
注意：
1)样品在上柱前可以离心或0.45μM微孔滤膜过滤。或者使用本试剂盒中附带的一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
2)通过控制加入的菌体裂解液的速度或流出速度来控制柱流速，流速过快会影响柱效。
3、洗涤：使用10倍柱体积的结合缓冲液过柱，洗涤杂蛋白，观察280 nm吸收情况并收集杂蛋白。建议洗涤流速为0.5-1ml/min(6ml层析柱)，1-2ml/min(12ml层析柱)。
注意：建议洗涤液中加入蛋白酶YZ剂终浓度为1mM，如蛋白酶YZ剂混合物，以YZ蛋白酶活性。
4、洗脱：使用10-15倍柱体积的新鲜配制的洗脱缓冲液过柱，洗脱目的蛋白，观察280 nm吸收情况并收集目的蛋白。建议洗涤流速为0.5-1ml/min(6ml层析柱)，1-2ml/min(12ml层析柱)。
5、蛋白检测：分别取等量的流穿液，洗涤液和目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE以分析蛋白的层析情况。
6、洗脱后，依次用3-5倍柱体积的结合缓冲液和3-5倍柱体积的去离子水洗涤填料，再用2-3倍柱体积的20%乙醇洗涤(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。

Ⅴ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有下降，可用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用5倍柱体积的再生缓冲液1洗涤填料，而后用5-10倍柱体积超纯水洗涤。
2、使用5倍柱体积的再生缓冲液2洗涤填料，而后用5-10倍柱体积超纯水洗涤。
3、保存：使用2-3倍柱体积的20%乙醇洗涤，将层析柱的头尾密封后(乙醇要将填料浸没)2～8℃保存。
4、再次使用时加入5倍柱体积的去离子水将乙醇洗涤后，使用10倍柱体积的结合缓冲液平衡填料，平衡结束后即可上样。

储存条件：2～8℃，避免冷冻


cDNA链合成试剂盒 核酸扩增(PCR)关键词：cDNA链合成试剂盒,BalbScript cDNA Synthesis Kit,WE0132

J0308                  兔抗大鼠IgG(H+L)抗血清                          
二乙三胺五乙酸 N-Acetylneuraminic Acid Aldolase 67-43-6
F030302 胶体金标记小鼠抗乙肝e抗原抗体 Monoclonal Mouse Anti-HBeAg*GOLD
盐*(代"酸")土霉素溶液(50mg/ml) Oxytetracycline 50mg/ml 10ml
F030439 胶体金标记山羊抗人IgG Fab抗体 Polyclonal Goat Anti-Human IgG Fab*GOLD
BL0879 兔抗人纤维蛋白原免疫血清 0.5ml
BTN130870 硫氧还蛋白 Thioredoxin
DN溶液(10%)   100ml
BTN70606 一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装 One-Stop miRNA Urea-PAGE Pack
A3601-15 马血清 100ml|500ml
ARB11920 人髓样分化因子初次应答基因88(MYD88)Elisa定量检测 Human myeloid differentiation primary response gene 88,myd88 ELISA KIT
ARB11091 人垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)代做ELISA实验 Human pituitary adenylate cyclase activating polyPeptide,pacap ELISA KIT
HC0140 插口不锈钢酒精灯(防泄漏防爆)
BTN131205 WGA糖蛋白分离试剂盒 Glycoprotein Isolation Kit(WGA)
无水*化金 AMPD 13453-07-1
Muller固定液   500ml
ARB13682 兔血管生成素2(ANG-2)含量分析 Rabbit angiopoietin 2,ang-2 ELISA KIT
ARB10470 人白介素1(IL-1)ELISA代测服务 Human interleukin 1,IL-1 ELISA KIT
F010203 小鼠抗人IgG Fab抗体 Monoclonal Mouse Anti-Human IgG(Fab)
ARB13713 兔骨桥素(OPN)Elisa方法检测 Rabbit osteopontin,opn ELISA KIT

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