分子克隆和质粒载体构建实验服务

实验技术简介：
分子克隆的相关载体：
DNA片段的克隆需要合适 的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点； 二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆，载体上常有筛 选标记，如对KJ素的抗性，某些基因产物的显色反应等。

一、质粒
常用的有pBR322，pUC系列质粒等。
（一）pBR322质粒是4362bp的环状双 链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转 化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外 源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。

（二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽 补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由 于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。

二、单链丝状噬菌体和噬粒
（一）大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等，其基因组均是单链闭环 DNA分子，其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体，所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝 白筛选的，M13感染大肠杆菌后，即在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA（正链）为模板，转变为双链DNA，称作复制型DNA（RF DNA）。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌 慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；从离心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA（ss DNA）供DNA序列分析，体外定位突变等使用。

（二）噬粒 （phagemid）在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样 操作，但当需要制备单链DNA时，就需要在培养时加入辅助噬菌体，常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后，上清中加入 PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外，还有 噬菌体和粘粒，详细情况可参阅有关资料。

质粒载体简介：
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单, 质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的 自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象 等来鉴别重组子和非重组子。

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
　　1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是Z容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序 列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
　　2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚 物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 限度地YZ质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
　　3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
　　特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线 状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

分子克隆的相关技术：
一、核酸的纯化
　　在分子克隆的所有操作中，Z基本的操作是核酸的纯化。其关 键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如 要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K 等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量 酚。①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。③12000×g室温离心15秒。④水相移入另一离心管，弃去两 相界面和有机相。⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。

二、核酸的浓缩
　　应用Z广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。

　　具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中 15－30min，取出目测平衡，0－4度，12000g，离心10min。吸弃上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗涤离心 2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。
单价阳离子盐溶液　
贮存液(mol/L) 终浓度(mol/L)
(醋酸铵* 7.5 2.0－2.5
LiCl 8.0 0.8
NaCl 2.0 0.2
醋酸钠 3.0（pH5.2) 0.3
*：当加醋酸铵时，需加入DNA液的V/2。
单 价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑 制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去 垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。

三、DNA、RNA的定量
　　准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白 质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收，然后，按IA260相当于 50μg/ml双链DNA。40μg/ml单链DNA或RNA及20μg/ml单链寡核苷酸。计算你的样品含量。260nm和280nm两处读数的比值 （A260/A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的A260/A280的值分别为1.8和2.0如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260 /A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。可将样品纯化后再作定量测定。有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光 带的强度，即可大致判断出样品中的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物
（一）琼脂糖凝胶电泳
　　可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。
DNA 通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA分子的大小：线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质 和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩 凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段
不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
浓度<%（w/v） 分离线状DNA分子的有关范围（Kb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
　
   DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ 型>Ⅱ型。④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压ZG时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的， 因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。
（二）聚C3H5NO凝胶电泳
　　可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段
DNA在聚C3H5NO凝胶中的有效分离范围
C3H5NO浓度<%(w/v)> 有效分离范围（bp）
3.5 100-1000
5.0 80-500
8.0 60-400
12.0 40-200
20.0 10-100
聚 C3H5NO凝胶多用垂直平板电泳，准备凝胶时，先配制30%单体母液（29克C3H5NO，1克双C3H5NO，加水溶解，定容至100ml），再用它来配制所需浓度 的凝胶。每100ml上述液体加30μFour methyl ethylamine（TEMED），混匀后即可灌注于予先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板，待凝胶灌至近顶端时，立即插入合 适的“梳子”，放室温聚合60分钟，若冬天室温太低，则可放37度温温箱内，以促进聚合。聚合完成后，拔出“梳子”，将凝胶板固定于电泳槽中，向电泳槽倾 入1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部以除去气泡，即可加样电泳。一般所用电压1-8v/cm，随时观察标记染米的迁移。在溶于1×TBE的聚C3H5NO中，标记染料迁移速率与下述DNA片段的速率相同
标记染料在PAG中的迁移*
凝胶浓度（%） 溴酚蓝 Xylene Cyanol FF
3.5 100 460
5.0 65 260
8.0 45 160
12.0 20 70
20.0 12 45
这些数字是与染料共同迁移的DNA片段的近似大小（以bp计）。电泳结束，从电槽中取出玻板并小心地撬开，凝胶浸于溴化乙锭液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外灯下观察电泳结果。
（三）分子量参照物
　 　为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。Z常用的分子 量参照物是 Hind Ⅲ消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。

实验注意事项：
客户提供：
1、原始模板信息：序列名称、载体名称、载体抗性、插入片段大小、是否对需要亚克隆的
序列进行测序（若已测序，请提供测序报告；若未测序，需另加收测序费用）。
2、亚克隆方式：5’ 酶切位点信息、3’ 酶切位点信息、目的载体信息（名称、抗性、大小、
是否经过改造）。如果目的载体经过改造，请提供改造后的全序列以及测序峰图；或至
少提供插入位点上下游各500bp以上的测序报告。
3、目的序列信息：两端加好酶切位点的目的序列。
交付标准：
1、高纯度质粒，大约2μg DNA，OD值在1.8～2.0之间；
2、含有重组质粒的甘油菌；
3、分析报告、测序图谱、质粒构建图、序列比对文件。