全组织抗酒石酸酸性磷酸酶活性染色试剂盒

全组织抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

全组织抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色试剂是一种旨在使用偶联偶氮技术，在酸性环境和酒石酸存在的情况下， 呈现出紫红色沉淀现象，来分析样本中抗酒石酸酸性磷酸酶表达的权威而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。主要适用于动物骨组织的抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测。可用于骨质细胞病理生理的研究的鉴定。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP）是一种在哺乳动物内表达的糖化单体金属蛋白酶，970多碱基，320多氨基酸，分子量为35kD。作为破骨细胞的标志，抗酒石酸酸性磷酸酶与破骨细胞调节的骨resorption活性和骨生成代谢有关。抗酒石酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通过蛋白酶裂解和还原后活化。在酸性环境下，催化磷酸酯键的水解，产生醇和释放磷酸。其特征性为酒石酸抗性而与其它酸性磷酸酶区别。抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨细胞（osteoclast）、活化的巨噬细胞、神经细胞以及怀孕期的猪内皮层子宫内膜（endometrium）高度表达。在网状内皮组织增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛细胞性白血病（hairy cell leukaemia）、戈谢病（Gaucher’s disease）、爱兹性脑病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨细胞瘤（osteoclastoma）、骨质疏松症（osteoporosis）和代谢性骨病等病人体内抗酒石酸酸性磷酸酶显著ZG。基于底物萘酚AS-MX磷酸盐（naphthol AS-MX phosphate），在酸性环境和酒石酸（tartrate）存在的条件下，酸性磷酸酶催化其水解，释放出萘酚（naphthol-AS），进而与重氮盐耐晒红紫（Fast red violet）偶联，于是在酶的活动处形成不溶性紫红色沉淀的偶氮染料，由此证明抗酒石酸酸性磷酸酶活性。其反应体系为：

TRAP

naphthol AS-MX phosphate  ＋  H2O  →  naphthol AS  ＋  phosphate

tartrate

naphthol AS  ＋  Fast red violet  →  azo dye

产品内容

清理液（Reagent A）   60毫升

固着液（Reagent B）   30毫升

反应液（Reagent C）  300微升

染色液（Reagent D）   30毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存反应液（Reagent C）和染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反复冻融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于配制染色工作液的容器

恒温培养箱：用于反应孵育

光学显微镜：用于细胞染色后观察分析

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的反应液（Reagent C）和染色液（Reagent D）从－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。然后移取3毫升染色液（Reagent D）到15毫升锥形离心管，加入30微升反应液（Reagent C），充分混匀后，标记为染色工作液，室温下，置入暗室。然后进行下列操作：

• 准备1个6孔细胞培养板
• 放进新鲜切除的动物骨组织样本（注意：建议组织大小为0.5厘米厚，1厘米长；如果过大，Z好刀切处理一下）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升固定液（Reagent B），浸没整个组织
• 在4℃条件下孵育15分钟
• 小心抽去固定液
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 在室温下孵育2分钟
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升染色工作液，浸没整个组织
• 放进37℃培养箱，孵育30分钟，或直至可见紫红色，避免光照
• 后续石蜡切片（6微米厚）或冰冻切片（10微米厚）
• 在光学显微镜下观察和计数：阳性细胞呈现紫红色，背景黄色

注意事项

• 本产品为10次操作
• 操作时，须带手套
• 原始组织大小可以1厘米厚、2厘米长进行染色，但建议越小越佳
• 染色工作液配制后，即刻使用，不得超过1小时，避免光照
• 染色工作液，根据实际需求，按比例配制试剂用量
• 如果样品中酶活性较低，染色可以延长至60分钟
• 染色注意不要过度
• 全组织染色存在其染色不均匀、组织内部染色渗透困难等局限
• 直接封片处理，不要使用有机溶剂（乙醇、二甲苯等），否则会使染色褪色
• 细胞染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 
• 本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰