琼脂糖凝胶法蛋白质西方杂交免疫印迹

琼脂糖凝胶法蛋白质西方杂交免疫印迹DAB显色检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

琼脂糖凝胶法蛋白质西方杂交免疫印迹DAB显色检测试剂盒是一种旨在将复杂的蛋白混合物经SDS-AGAROSE GEL分离后，转移到固相膜上（如NC、PVDF）等，经过非特异结合位点的封闭处理， 进行辣根过氧化酶（HRP）标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）和间接（标记二抗）反应，然后由二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）作用显示为棕色（过氧化酶活性），以记录其免疫印迹的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于目标蛋白的免疫学检测。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，检测敏感，显色清晰，重复性好。

技术背景

传统的蛋白质电泳和西方杂交（Western Blot）使用SDS PAGE电泳进行蛋白分离，然后转印。琼脂糖凝胶法使用低熔点琼脂糖，相较于传统SDS-PAGE方法，具有分辨力高、敏感性高（50倍）、染色均匀、转印效率高、背景噪音低和稳定性好等优点。其可以分辨6至大于200Kd蛋白质范围。上样蛋白仅需10至50纳克。西方杂交印迹技术（Western Blot）用于检测固定在固相免疫印迹膜上的20pg以上蛋白。辣根过氧化酶（HRP）是Z常见的酶促显色的交联酶，其比活性高、特异性强、分子量小、稳定。HRP的生色底物显色利用底物在HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）和HRP作用形成棕褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好。

产品内容

胶底液（Reagent A）  25毫升

凝结液（Reagent B） 500微升

促进液（Reagent C）  50微升

胶体液（Reagent D）   2 X 50毫升

电泳液（Reagent E）      500毫升

上样液（Reagent F）   1毫升

转印液（Reagent G） 125毫升

封阻液（Reagent H）      100毫升

清理液（Reagent I）      250毫升

显色液A（Reagent J）       10毫升

显色液B（Reagent K)）  90毫升

产品说明书       1份

保存方式

保存凝结液（Reagent B）和显色液A（Reagent J）在－20℃冰箱里；保存上样液（Reagent F）、封阻液（Reagent H）和显色液B（Reagent K）在4℃冰箱里, 其余的保存在室温下；显色液A（Reagent J），避免光照，有效保证6月

用户自备

恒温水槽：用于均衡胶体温度

电泳仪系统：用于蛋白电泳

甲醇：用于印迹膜处理

无离子水：用于配制工作液

PVDF固相膜：用于蛋白转印的固相载体

一抗和辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗：用于免疫结合反应

50毫升锥形离心管：用于配制工作液的容器

15毫升锥形离心管：用于配制工作液的容器

三角烧瓶：用于配制工作液的容器

塑料袋（盒）：用于清洗、封阻、结合等操作

转印仪：用于蛋白印迹转移的仪器

平式震荡仪：用于孵育和混匀反应

实验步骤

一、电泳

实验开始前，移取50毫升电泳液（Reagent E）到500毫升容器里，加入450毫升用户自备的无离子水，混匀后，标记为电泳工作液。然后进行下列操作。

• 移出5毫升胶底液（Reagent A）到15毫升锥形离心管里
• 加入100微升凝结液（Reagent B）
• 加入10微升促进液（Reagent C）
• 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡
• 在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
• 将胶体液（Reagent D）放进微波炉融化（注意：避免溢出）
• 至于65℃恒温水槽均衡温度
• 即刻移取适量的胶体液（Reagent D）到玻璃槽中，避免气泡
• 插入1毫米厚的15孔梳
• 在室温下孵育45分钟，或直至胶体凝结
• 将玻璃槽移入到电泳槽里
• 加入适量的含有电泳液（Reagent E）的电泳工作液
• 小心拔去15孔梳
• 用吸管或1毫升枪头冲洗样品孔备用
• 从－70℃冰箱里取出待测样品（注意：样品须澄清；参见注意事项3）
• 移取10微升样品（20微克总量）到1.5毫升离心管
• 加入10微升上样液（Reagent F），混匀
• 煮沸5分钟
• 室温下静置10分钟
• 小心移取20微升样品到玻璃槽的样品孔里（包括用户自备的蛋白标准样）
• 电泳运行1至2小时，电压为100伏或电流20毫安，直至染料前沿到达胶底处
• 关闭电源
  • 转印

• 移出25毫升转印液（Reagent G）到250毫升三角烧瓶里
• 加入225毫升用户自备的无离子水，充分混匀后，标记为转印工作液（总共250毫升）
• 放进4℃冰箱里预冷
• 拆除电泳装置，取出电泳玻璃板块
• 分离玻璃板快，切除聚集胶体部分（STACKING GEL）
• 放入分离胶体（RESOLVING GEL）到塑料盒里
• 加入100毫升预冷的转印工作液
• 同时剪下用户自备的5 cm X 8 cm PVDF转印膜
• 放进新的塑料盒里
• 加入50毫升用户自备的100％甲醇浸湿PVDF转印膜
• 倒掉甲醇
• 加入50毫升转印工作液浸湿PVDF转印膜
• 用剩下的100毫升转印工作液使过滤纸湿润
• 组成三明治结构进行湿润转印（WET TRANSFER）过夜
• 或在4℃温度下进行电转印：

选择运行过夜：电压50伏或电流150-200毫安

选择运行3至4小时：电压120伏或电流400毫安

• 封阻

• 移出20毫升封阻液（Reagent H）到100毫升三角烧瓶里（注意：使用前，室温预热，摇匀封阻液）
• 加入80毫升用户自备的无离子水，充分混匀后，标记为封阻工作液
• 移出50毫升清理液（Reagent I）到500毫升三角烧瓶里
• 加入450毫升用户自备的无离子水，充分混匀后，标记为清理工作液
• 倒掉内有PVDF固相膜的塑料盒里的转印工作液
• 加入75毫升封阻工作液
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育2小时，速度为50RPM
• 小心倒掉封阻工作液
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育5分钟，速度为50RPM
• 小心倒掉清理工作液
• 重复实验步骤9至11一次

• 结合

• 将PVDF固相膜放进塑料袋里
• 加入10毫升含有一抗的封阻工作液（注意：一抗浓度通常为每毫升1微克）
• 将塑料袋封口
• 确保液体铺满整个固相膜表面
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育6小时，速度为50RPM
• 取出PVDF固相膜，放进塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育5分钟，速度为50RPM
• 移去清理工作液
• 重复实验步骤7至9三次
• 将PVDF固相膜放进新的塑料袋里
• 加入10毫升含有二抗的封阻工作液（注意：二抗浓度为1：10000）
• 将塑料袋封口
• 确保液体铺满整个固相膜表面
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育45分钟，速度为50RPM
• 取出PVDF固相膜，放进塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育5分钟，速度为50RPM
• 移去清理工作液
• 重复实验步骤17至19三次

• 显色

显色实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的显色液A（Reagent J）和4℃冰箱里显色液B（Reagent K）置于室温下，然后分别移出1毫升A液和9毫升B液到15毫升锥形离心管，混匀后标记为显色工作液，避免光照。显色液A（Reagent J）即刻放回－20℃冰箱里。

• 加入10毫升室温预热的显色工作液，铺满整个PVDF固相膜表面
• 置于平式震荡仪上，在室温下孵育2至5分钟，或直至棕褐色沉淀出现，速度为50RPM
• 用镊子夹起固相膜，放进用户自备的无离子水里清洗
• 空气中晾干
• 数码相机拍照记录

注意事项

• 本产品为5次操作
• 操作时，须戴手套
• 如果使用半干式电转印，则转运运行1小时，电压为15至20伏
• 转印工作液建议在4℃冰箱里预冷
• 显色时间需根据情况调整，不能过长，否则造成过度显色
• 显色液具有毒性或刺激性，注意操作安全
• 显色液A（Reagent J）避免反复冻融
• 固相膜显色后数小时将会褪色，不能保存
• 本产品的显色液只能用于辣根过氧化酶（HRP）标记的杂交
• 本公司提供系列蛋白杂交试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰