精子活力和顶体反应三色染色试剂盒

精子活力和顶体反应三色（triple staining）染色试剂盒产品说明书（中文版）

 

主要用途

 

精子活力和顶体反应三色（triple staining）染色试剂是一种旨在使用台盼蓝、孟加拉红和俾斯麦棕Y三种染料特异性着色死亡精子、完整顶体以及顶体后区，产生蓝、红棕色，从而确定细胞活力以及精子功能（顶体反应）的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种动物或人体精子细胞。产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，着色清晰。

 

技术背景

 

在男科学（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子寿命、以及生育能力的基础信息。其中精子的活力（vitality）、运动能力（motility）、授精潜力（fertilizing potential）、膜结构完整性（integrity）、顶体反应（acrosomal reaction）功能的评价是精子分析的重要指标，也是决定人工受孕或体外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要参数。其中顶体反应，是指当精子接近卵子实施授精时，精子头部前半端的帽状结构顶体，释放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。顶体反应测试是一项稳定的精子功能参数，可以用于预测受精成功率。因此顶体的结构完整性（intact）是评价的主要标志，也是不育症和避孕药物研究的对象。三色（triple staining）染色首先使用台盼蓝（trypan blue）染色，分析精子活力，基于台盼蓝受到活体精子细胞（包括游动性和非游动性精子）的排斥，而死亡精子细胞摄入染料显示红色的原理。其次使用孟加拉红或虎红（Rose Bengal）染料与顶体内含物的结合，区别完整性（未反应性unreacted）顶体，以及俾斯麦棕Y（Bismark Brown Y）染料识别顶体后区（post-acrosomal region）染色。通过常用的一般光学显微镜（无需相差显微镜；phase-contrast microscope）便可清晰观察到顶体缺失状态。

 

产品内容

 

一染液（Reagent A）    2.5毫升

清理液（Reagent B）    50毫升

固定液（Reagent C）    25毫升

二染液（Reagent D）    10毫升

三染液（Reagent E）    10毫升

产品说明书 1份

 

保存方式

 

保存在4℃冰箱里，避光，有效保证6月

  

用户自备

 

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

恒温水槽或培养箱：用于孵育反应

微型台式离心机：用于样品操作

血细胞计数器：用于细胞计数

盖玻片：用于精子细胞爬片

一般光学显微镜：用于观察染色的精子细胞

 

实验步骤

 

• 移取新鲜获得的精液（30分钟至1小时内）到1.5毫升离心管
• 放进37℃恒温水槽孵育30分钟
• 轻柔涡旋震荡5秒
• 移取50微升上述精液到新的1.5毫升离心管
• 加入50微升一染液（Reagent A）
• 用200微升枪头上下抽吸混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
• 即刻移取10微升到洁净的载玻片
• 盖上盖玻片 
• 即刻在一般光学显微镜下（1000倍；即油镜下）观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）

蓝色染色的精子细胞为死亡细胞，而不染色的精子细胞为活体细胞

• 将1.5毫升离心管放进微型台式离心机离心10分钟，速度为600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升清理液（Reagent B），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升固定液（Reagent C），混匀
• 室温下孵育60分钟
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入100微升清理液（Reagent B），混匀
• 即刻移取12微升到洁净的载玻片一端
• 用盖玻片或另一个载玻片推片
• 置于空气中凉干
• 小心加上200微升二染液（Reagent D）在载玻片上，覆盖样品表面
• 放进40℃恒温培养箱孵育5分钟
• 即刻移去二染液（Reagent D）
• 小心加上200微升清理液（Reagent B）在载玻片上，覆盖样品表面
• 即刻移去清理液（Reagent B）
• 小心加上200微升三染液（Reagent E）在载玻片上，覆盖样品表面
• 室温下孵育30分钟
• 即刻移去三染液（Reagent E）
• 小心加上200微升清理液（Reagent B）在载玻片上，覆盖样品表面
• 即刻移去清理液（Reagent B）
• 封片
• 即刻在一般光学显微镜下（1000倍；即油镜下）观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）

粉红色顶体和浅棕色顶体后区――活体精子未反应完整顶体 

无色顶体和浅棕色顶体后区――反应后顶体（或顶体缺失）――阳性顶体反应

蓝色精子细胞、粉红色顶体和浅棕色顶体后区――死亡精子未反应完整顶体

无色顶体和无色顶体后区――死亡或冻存后、损伤后精子退化顶体（或顶体缺失）

 

注意事项

 

• 本产品为50次操作
• 操作时须戴手套
• 样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数，同时观察精子游动
• 精子细胞计数时乘上稀释倍数10⁴。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：

1毫米方块的细胞计数X 10⁴（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升

• 避免一染液（Reagent A）染色时间超过15分钟，否则由于其毒性导致精子细胞死亡
• 本产品可用于染色稀释过的或冻存过的精子细胞 
• 本公司提供系列发育生物学相关检测试剂产品

 

质量标准

 

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定着色清晰