一、服务介绍
串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)是用分子克隆技术将2 个连续的标签基因与靶蛋白基因相连,通过表达载体将融合蛋白基因导入目标细胞,控制靶蛋白表达量,在接近生理状态下利用与标签相互作用的亲和柱对细胞裂解液进行两步洗脱, 从而得到靶蛋白及其相互作用蛋白的一种蛋白纯化技术。
串联亲和纯化的优点在于,一方面是用亲和柱结合标签,而不直接作用于目的蛋白,纯化过程不用过多考虑靶蛋白的性质;另一方面是采用串联标签, 经两步纯化,有效减少了杂蛋白含量,为后续蛋白分析减少了工作量。
二、实验原理
以Z常用的AC-TAP标签为例,标签共分3部分:蛋白A、钙调素结合多肽(calmodulin binding peptide,CBP)和中间连接的烟草病毒(TEV)蛋白酶识别的酶切位点。带有TAP标签的融合蛋白在细胞中表达,且与内源相互作用蛋白形成复合物,细胞裂解后经IsG偶联的层析柱纯化,蛋白A与IgG特异结合,从而使含有标签的复合物得到次纯化。为除去与柱填料非特异结合的蛋白,用TEv酶切割分离蛋白A标签,使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离,并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化,靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合;在加入过量螯合剂后CBP与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化。
三、服务流程
- TAP 标签与目标基因融合表达载体的构建
- 转染入相应的靶细胞
- 蛋白复合物的两次亲和纯化
- SDS-PAGE
- 质谱分析
注意点:TAP 标签蛋白的选择;TAP 标签蛋白结合在目标蛋白的C端还是N端。
四、客户提供
- 目的基因的名称、序列、物种等相关信息;
- 相应抗体;
- 待研究细胞;
- 其他技术要求。
五、交付内容
实验报告,包括实验流程、仪器方法、原始数据等。
周期:5-6周