EvaGreen--实时qPCR和HRMZJ选择

Fast-Plus EvaGreen® Master Mix

新一代GX、安全无毒的荧光定量PCR试剂盒

美国BIOTIUM公司生产的 Fast-Plus EvaGreen® qPCR master mix 是一种用于荧光定
量PCR以及高分辨率熔解曲线分析的即用型试剂盒。该试剂盒囊括了两项PCR领域的突破性技术：GX、无毒的EvaGreen® qPCR染料和 可快速激活的化学修饰型热启动DNA聚合酶Cheetah™ Taq 。相比其他的商业化PCR master Mix，Biotium公司的产品可以为客户带来更为精确的实验结果。该试剂盒有3种不同的类型可供客户选择,分别是无ROX染料、LOW ROX、HIGH ROX，客户可根据具体仪器以及实验要求进行选择。(选择指南请见表-1)
该试剂盒所使用的EvaGreen® 染料是Biotium公司研发的新一代DNA结合染料， 它同时适合于实时定量PCR以及高分辨率熔解曲线分析（HRM）。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性结合双链DNA，从而大大降低了染料对PCR反应的YZ作用。
 

EvaGreen®染料的另一个重要的特性是安全、无毒。目前商业化的核酸染料大都会诱导基因的突变，而且很少做过完整的毒性研究，这对使用者的健康存在着巨大的潜在危害。比如在PCR实验中常用的SYBR® Green I染料，有文献报道其比EB具有更大的环境毒性(Ohta, et al. Mutation Research, 492,91-97(2001)).，虽然SYBR™ Green I 本身诱变性很弱，但由于它可能在活细胞中YZ正常DNA的修复机制，使其有诱变增强的作用。考虑到PCR的广泛使用，核酸染料的安全性应该被足够重视，基于以上的理念，Biotium的科学家研发出了新一代的核酸染料EvaGreen®。EvaGreen™ 由于降低了细胞膜穿透性，因而比SYBR™ Green I更加安全（图-2）。独立实验室的测试结果显示，EvaGreen™ 既没有诱变性也没有细胞毒性，废弃物可直接倒入下水道。（EvaGreen™完整的安全性报告可以从Biotium网站上下载）

Fast-Plus EvaGreen® qPCR master mix 另一个重要组分是Cheetah™  Taq 热启动DNA聚合酶。它可以YZ或将PCR反应中的非特异性DNA扩增最小化。由于使用了创新的修饰试剂，Cheetah ™ Taq的品质得以提升。和AmpliTaq® Gold以及其他相似的热启动聚合酶相比激活时间更短，活性时间更长。在标准的热启动条件下(94°C时在 pH 8-9的Tris缓冲液中)，Cheetah™ Taq只需2分钟就可以恢复5'-3'聚合酶活性和5'外切酶活性。Cheetah™ Taq同样也优于基于抗体技术的热启动聚合酶，源于Cheetah™ Taq在室温下能完全YZ酶活性而激活后几乎能完全恢复。
Fast-Plus EvaGreen® qPCR master mix可适用两步法RT-PCR反应用于mRNA定量分析。先将mRNA反转录为 cDNA ，再使用本试剂盒进行后续实验。为保证实验的结果， 建议cDNA 样品体积不超过整个PCR体系的10%。为减少基因组DNA对实验的影响，推荐使用非RT产物的DNA为对照。
 

本RT-PCR试剂盒也可使用一步法进行mRNA 定量分析，引物需经过良好的设计以避免引物二聚体的形成。我们推荐在反转录过程中滴定检测反转录酶的总量。 经检测以下公司的反转录酶兼容本试剂盒： Agilent、 Fermentas、Lucigen和 Life Technologies. 建议设计的引物退火温度为55 oC, 这样反转录和扩增的过程能够在55 o C同时运行。为减少基因组DNA对实验的影响，推荐使用非RT产物的DNA为对照。

Fast-Plus EvaGreen® qPCR master mix的另一个优点是：试剂盒中Eva green 染料可以为DNA预染，从而无需加入其它与核酸染料便能直接在凝胶成像系统下观察分析

EvaGreen® 无穿越细胞膜的活性，是WY无细胞毒性、无诱变性的PCR染料，对人体安全无毒。

	A) 5 min. 孵育	B) 30 min. 孵育	C) 30 min. 孵育, long photographing exposure time
SYBR Green I				图2. EvaGreen® dye 和 SYBR® Green 细胞膜穿透性比较试验。. HeLa细胞分别加入 SYBR® Green I (1.2 µM)、 EvaGreen® dye (1.2 µM) 在37 oC孵育，分别在5分钟和30分钟时间并用荧光显微镜观察. SYBR™ Green I孵育5min后观察到明显的细胞染色，在30min后，SYBR™ Green I组细胞核内观察到大量绿色荧光（左图）。这说明SYBR™ Green I能快速穿透细胞膜，加上它已知的诱变增强性（Ohta et al. Mutation Research 492, 91(2001)），其对PCR试验的操作者存在的毒性甚至超过EB。这个实验可以说明EvaGreen®  无穿越细胞膜的活性，是WY无细胞毒性、无诱变性的PCR染料，对人体安全无毒。See full EvaGreen dye safety report at Biotium website.
EvaGreen

Table 1. Fast Plus EvaGreen® Master Mix selection guide

Table 2.Ordering Information

世界著名期刊论文：

Detection of aacA-aphD qacEδ1 marA floR and tetA genes from multidrug resistant bacteria comparative analysis of real-time multiplex PCR assays using （2011.01）

Incidence of prey DNA types in Bryde's whale scats

LETTER TO THE EDITOR Evidence for the expression of both the MT1- and in addition, the MT2-melatonin receptor, in the rat pancreas, islet and b-cell