神经性贝类毒素（NSP）检测试剂盒

本检测采用酶联免疫法定量检测神经性贝毒的存在。神经性贝毒是一种毒素，与贝壳类动物的神经中毒有关。本检测可用于水产样本对贝类毒素的定性和定量检测，例如甲壳类动物的样本。对于甲壳类动物的需要提前制备样本。如果条件允许，阳性样本可以做HPLC，GC/MS或其他方法确认。

标准品溶液含有少量的神经性贝毒。底物溶液含有四甲基联苯胺，终止液还有稀硫酸。避免皮肤与粘膜与终止液接触。若终止液与皮肤接触，可用水洗去。

试剂盒贮存在4-8°C。使用前试剂盒中溶液要恢复到室温20—25度。在保质期内试剂盒都可以正常使用。

本实验采用直接竞争ELISA方法，用特异性抗体识别神经性贝毒。样本中的神经性贝毒可与贝毒-酶-结合物竞争，同包被在微孔板上的羊抗-神经性贝毒抗体结合。洗板加入底物溶液，显蓝色。蓝色的深度与神经性贝毒在样本中的浓度成反比。颜色反应在规定时间内终止，颜色用酶标仪读值。每孔的样本浓度值可以通过标准曲线来读取。

样本中经常存在的大量的无机物和有机物经检测，并未为发现影响试剂盒的检测结果。然而，由于样本中发现有易变质的混合物，由它们引起的基质反应不可避免地会影响检测结果。操作失误也可能造成实验错误。如：贮存的问题。加样次序错误，加入溶液的体积错误，孵育的时间过长或者过短，影响免疫反应或者底物反应，实验过程中温度过低或者过高（低于10℃，大于30℃）。本试剂盒提供筛查神经性贝毒的筛查结果。阳性样本可采取其他的分析方法（GC,HPLC，其他方法）证明。

1.     包被绵羊抗-神经性贝毒的酶标板

2.     标准品PbTx-3 (8): 0, 0.010, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 2.0 ng/ml

3.     辣根过氧化酶（HRP）-神经性贝毒结合物，6ml

4.     浓缩的样本稀释液（1X）2 X 30ml,用于稀释样本

5.     浓缩的洗液（5X），100ml

6.     显色液（TMB）,12ml

7. 终止液，2 X 6ml

8.海水前处理溶液25ml

1.     按照既定计划，在放置有酶标条的孔中加入标准品溶液或者海水或者甲壳类样本提取液50цl。推荐做双份或者三分重复。

2.     用多道移液器或者可调移液器连续加入50цl的酶结合物于各微孔孔中。封板，放置在振荡器上震荡30秒。防止溅出。室温孵育60分钟。

3.     孵育完毕，揭开板子，强烈摇起板孔中的沉淀。1X洗液洗板3次。每孔每次最少用250цl的洗液洗涤。残留的液体需要放置在干净的纸上拍干。

4.     每孔加入100цl的底物溶液。室温30分钟孵育。避免直接光照。

5.     按照加入底物溶液的顺序，每孔依次加入100цl的终止液。

6.     加入终止液后15分钟内450nm读取吸光值。

结果分析可以利用商业ELISA分析软件(4-parameters,Logit/Log)。手工计算可以先计算标准的吸光度值的平均值，然后计算每个标准的%B/B0（用其它标准的吸光度值除以零标准的吸光度值乘以100%）。以每个标准的%B/B0做Y轴，以每个标准的神经性贝毒的浓度做X轴构建标准曲线。通过利用标准曲线，把对照和样品的%B/B0代入标准可以计算出样品中神经性贝毒的浓度。样品中神经性贝毒的含量小于0.01 ppb认为阴性。当样品中神经性贝毒的含量大于2.0 ppb要稀释后再测定。