红细胞的分离技术
(一)材料与试剂
1.肝素等抗凝剂
2.3%明胶液 取明胶3g,溶于0.9%灭菌盐水100ml中,114.3℃灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存。临用时,37℃预热10min。
3.阿氏液
(二)操作方法
1.采血抗凝,即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计。
2.根据红细胞的用途,可做进一步的处理。如计算红细胞,可直接稀释计数。如需做补体结合反应,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复3~4次。
3.如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4℃冰箱保存,可保存2周,其活性尚可。
四、淋巴细胞的分离技术 (
(一)材料与试剂
1.淋巴细胞分层液有两种:
(1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售。应用时,用蒸馏水配制9%溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影。应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制:
9%聚蔗糖液 24份
33.9%泛影葡胺液 10份
混合即可。必要时,可测比重。需要备用,可用G5漏斗过滤CJ或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存。一般可保存3个月。
如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:
式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。
(2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液
34%泛影葡胺液 10份
60%右旋糖酐液 12.5份
混合,即为比重1.07~1.09的分层液。分装于棕色瓶中,4℃冰箱保存备用。
2. 3%的明胶液 称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min。
3.Hank’s液。
(二)操作方法
1.取抗凝血,自然沉降,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上,让其自然沉降1h,取上层血浆。如是牛、羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然沉降,1h后取上层血浆。
2.2 000r/min离心10min,弃上清。
3.沉淀用Hank’s液混悬后,再2 000r/min离心10min。
4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群,包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。
5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆(自然沉降1h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可。
6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min。离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层,即为单个核细胞层。
7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中。
8.以Hank’s液洗涤、离心,ZH配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。
(三)注意事项
1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。
2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离。
3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞。
五、单核细胞分离技术
(一)铁粉吸附法
1.材料及试剂
(1)铁粉或羰基铁粉(Atomergic chemetals)99%的纯度,颗粒小于60µm(Goodfellow Metals)。
(2)强磁铁(马蹄形)。
(3)一块小棒状磁铁(约1cm长)。
(4)毛细吸管等。
2.操作方法
(1)称取一定量的铁粉,一般为10g,用100ml生理盐水洗涤4次,去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时,用强磁铁吸住铁粉。
(2)用50ml生理盐水混悬铁粉。摇匀后,分装于10个瓶中,包扎瓶口,121℃灭菌20min,拿出后立即轻轻摇匀,防止铁粉结块,储藏备用。
(3)临用前,倒去瓶中的生理盐水,加入适量的单个核细胞悬液(3ml~5ml,细胞总数为8×107个/瓶)。37℃温育45min,中间不时晃动,使铁粉悬浮起来。
(4)加入一块小磁铁棒于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。
(5)倒出悬液,此悬液主要是淋巴细胞,离心,收集。
(6)在铁粉瓶内倒入一定量的Hank’s液,用力振摇后,以强磁铁吸附,几分钟后,倒出液体。
(7)2 000r/min离心液体,管底即为单核细胞。
(二)玻璃板吸附法
将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内,置37℃ 30 min~40min,用毛细吸管轻轻吸取悬液,即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿,收获即为单核细胞悬液。
六、T淋巴细胞的分离技术
(一)原理
混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,这是获得富含T细胞群的有效方法。
(二)材料及试剂
1.尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters Polysciences Inc)。
2.烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
3.装填尼龙毛柱,一次性注射器。
4.取自然沉降的上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。
(三)操作方法
1.尼龙毛的清洗与干燥
(1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。
(2)冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干。
(3)重复(1)、(2)步骤6次。
(4)将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2~3天后,贮藏在带盖的方盘内。
2.装尼龙毛柱
(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管。
(2)将尼龙毛梳理,并适当折叠,以适应注射器的直径,填入注射器内,约20ml的体积。
(3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌。
3.细胞分离
(1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门。
(2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞/ml。
(3)将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱。盖上注射器,37℃温育45min
至1h。
(4)打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中。
(5)离心,即获所需的T淋巴细胞。
(6)关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。
(四)注意事项
1.此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的松紧也有关系。
2.此法的T淋巴细胞的回收率约20%~30%。
3.用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗。
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