乙酸检测试剂盒/D-异柠檬酸测定试剂盒

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D-异柠檬酸测定试剂盒 (D-CITRATE)

操作说明书 

订货号: 10015 (100次测定)

简介:

D-异柠檬酸存在于所有动植物体内,通常含量很低,它是柠檬酸循环的一部分.在检测果汁(尤其是桔汁)中是否含有非法添加剂(掺假)方面,D-异柠檬酸的检测非常重要.不仅要检测含量,还要检测柠檬酸/D-异柠檬酸比例,若此比例太高则意味着添加了柠檬酸.

原理:

在异柠檬酸脱氢酶(ICDH)作用下,D-异柠檬酸被尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)氧化生成2–酮戊二酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)以及CO2.

(1) D-异柠檬酸 + NADP+ (ICDH) 2-oxoglutarate + CO2 + NADPH + H+

生成的NADPH的量取决于D-异柠檬酸的量,NADPH的吸光度值可在340下测量.

限制性的D-异柠檬酸可以通过加碱水解后(2), (3),再利用同样的原理进行测定(1).

(2) D-Isocitric acid ester + H2O (pH 9-10) D-异柠檬酸 +乙醇

(3) D-异柠檬酸内酯 + H2O (pH 9-10) D-异柠檬酸

特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:

该实验方法是专门用于测定D-异柠檬酸含量的.

最小可调吸光光度为0.005个吸光单位,样品体积为2.00mL(或对于浓度为3.54mg/L样品体积为0.10mL),若在340nm下检测,此时的D-异柠檬酸浓度为0.177mg/L.如果最小可调吸光光度为0.01吸光光度,样品体积为2.00mL,在340nm下检测,此时的D-异柠檬酸检测线为0.354mg/L.

该实验的测量范围为1-80ug D-异柠檬酸,同一样品分别进行两次测定,其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化,对于样品体积为2.00mL,此时的D-异柠檬酸浓度大约在0.177-0.354mg/L之间,如果样品是经过稀释的,在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数(F),如果在样品制备阶段,样品的重量是被称量的,如:10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨.

干扰:

如果D-异柠檬酸在试验规定的时间内(大约3分钟)完成转化过程,通常认为没有干扰发生,然而,通过向已完成反应的试管中添加D-异柠檬酸(0.1mL中添加30ug),进一步的验证实验,吸光度值还将进一步增加.

利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定.定量回收试验:通过向样品中添加标准质控,计算样品在处理和提取时的损失.如:在最初的提取步骤时添加一定量的D-异柠檬酸.

安全性:

D-异柠檬酸测定所使用的试剂没有有毒物质.然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v),需要按照实验室安全操作规程进行试验.

试剂盒:

MegazymeD-异柠檬酸含量测定试剂盒可以进行100次的测定试验,并提供有全部的试验方法:

瓶1: Tris/HCl 缓冲液 (12mL, 2 M, pH7.6) +氯化镁(100mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)

稳定性> 2年,4°C保存.

瓶2: NADP+(165 mg)

稳定性> 5年,-20°C保存.

瓶3: 异柠檬酸脱氢酶(1.8 U/mL),悬浮液2.1 mL.

稳定性> 2年,4°C保存.

瓶4: D-异柠檬酸质控标准液(5 mL, 0.3mg/mL) +叠氮化钠(0.02 % w/v)

稳定性> 2年,-20°C保存.

试剂制备:

1.备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用.

2.用10.2mL 蒸馏水溶解瓶2,按照试验用量分装到试管中,一旦溶解,保存于-20°C下稳定性> 2年,使用时保存于冷藏室或冰盒中.

3.准备瓶3溶液,DY次打开前,需要充分晃动瓶子,不要让酶吸附在橡皮塞上,然后垂直存放好瓶子.每次使用前还需要充分混合其中的内溶物.

4.准备瓶5溶液随时使用.

注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质YZ了试验,再使用D-异柠檬酸标准质控溶液进行测定,通过测量NADPH的消光系数而计算D-异柠檬酸的浓度.

实验需要的设备:

1. 玻璃试管(圆底；16 x 100 mm).

2. 比色管(1 cm light path, 3.0 mL).

3. 微量移液器(20和100uL).

4. 连续分配器

5. 分析天平.

6. 分光光度计340 nm.

7. 漩涡混合器

8. 定时钟

9. Whatman No.1和GF/A玻璃纤维(9 cm)滤纸

操作步骤:

波长: 340 nm

比色杯: 1 cm light path (玻璃或塑料)

温度: 25°C

ZZ体积: 2.32 mL

样品溶液: 每个比色杯中含有1.0-80ug D-异柠檬酸(存在于0.10-2.0mL样品溶液中)

空白调 0:相对于空气或者水

溶液 空白管 样品管
蒸馏水(~ 25°C)
样品

溶液1(Tris/HCl缓冲液)

溶液2(NADP+缓冲液)
2.10 mL —
0.10 mL

0.10 mL
2.00 mL
0.10 mL

0.10 mL

0.10 mL

混合*,在反应大约3分钟后读取溶液的吸光度值(A1),然后立即添加下列试剂继续反应
悬浮液3(ICDH) 0.02 mL 0.02 mL
混合*,在停止反应后(大约3分钟)读取溶液(A2)的吸光度值.

* 用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒