编号:ALH197
规格:50μl×50次|50μl×100次
产地:国产|进口
品Pai:百奥莱博
英文名:One Step heat-resistant qRT-PCR Kit
本试剂盒是采用SYBR Green I 嵌合荧光法进行Real Time PCR 的专用试剂,用本制品进行Real Time qRT-PCR 可在同一反应管内连续进行。反应过程中无需打开
管盖添加试剂并可对扩增产物进行实时检测,避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。非常适合于微量RNA 尤其是微量RNA病毒的检测。本试剂盒包括
适合Real Time PCR的突变改造M-MuLV H Minus逆转录酶(THERMOscript RTase)、热启动HotMaster Taq DNA聚合酶和RNasinYZ剂mix、同时包含适用于逆转录和
PCR扩增的优化独特反应体系。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失,与M-MuLV 相比,具有更强的延伸能力和稳定性。同时该酶多点突变提高了耐热性,
可以在50℃反转录,提高了复杂二级结构,GC含量丰富模板反转录效率。而采用优质热启动酶HotMaster Taq DNA Polymerase可以Z大限度的减少PCR扩增全程中
的非特异性扩增产物产生,大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因进行准确定量检测,重复性好
,可信度高。
试剂盒组份(50次):
2×qRT-PCR Mix(含Sybr Green I)———————1.25ml
Enzyme Mix—————————————————50μl
耐热反转录酶————————————————50μl
RNase free H2O———————————————1.5ml
适用范围:适用于高拷贝、低拷贝基因检测;部分高GC 含量或具有复杂二级结构的RNA 模板。
注意事项:
1. 当同时需要进行数次Real Time One Step qRT-PCR反应时,应先配制各种试剂的混合液(Master Mix,其中包括RNase-free ddH2O、Buffer、各种酶等),然
后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确,减少试剂损失,避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
2. 使用Enzyme Mix和RTase时,分取之前要小心地瞬间离心收集到反应管底部;由于酶保存液中含有高浓度的甘油,粘度高,分取时应慢慢吸取。
3. 2×qRT-PCR Mix内含Sybr Green I,保存或配制One Step qRT-PCR反应液时应避免强光照射。
4. 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。
5. 不同的片段,所需RNA模板用量不同,过多的RNA会YZ反应,建议根据反应调整模板用量。
6. 只能使用特异性引物,不能使用Oligo(dT) 和Random Primer 进行反应。
储存条件:-20℃,有效期12个月。
本品别名:一步法荧光定量耐热RT-PCR试剂盒|一步法耐热qRT-PCR试剂盒|一步法耐热RT-qPCR试剂盒|耐热一步法qRT-PCR试剂盒|耐热一步法RT-qPCR试剂盒
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·石蜡包埋组织miRNA提取试剂盒
编号:ALH074
英文名称:Paraffin Embedded Tissues microRNA Extraction Kit
规格:50次
本试剂盒用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取RNA包括microRNA。独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞释放出RNA,然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱,基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
产品组分:
裂解液——————15ml
结合液——————25 ml
漂洗液——————10ml
蛋白酶K——————20mg(可选)
RNase-free H2O——————10ml
基因组DNA清除柱和收集管——————50套
RNA吸附柱和收集管室温——————50套
产品特点:
1.完全不使用有毒的苯酚,氯*(代"仿")等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
2.快速,简捷,单个样品RNA提取操作一般可在1小时内完成。
3.试剂盒的独特基因组清除柱和配方确保有效清除基因组DNA残留,一般情况下得到的RNA不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
4.多次柱漂洗确保RNA高纯度,可直接用于下游各种实验。
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 样品处理量不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱处理能力,否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大,例如胸腺脾脏DNA含量丰富,超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富,超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3. 裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 预防RNase 污染,应注意以下几方面:
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase 污染。
2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA提取过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC 至终浓度0.1%( v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
5. 关于DNA 的微量残留:
一般说来任何总RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA 的微量残留(DNase 消化也无法做到无残留),本试剂盒采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA 清除柱技术,绝大多数DNA 已经被清除,可直接用于反转录PCR 和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA 表达量分析荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA 中的连接区,这样DNA 就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA 和cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。
6. RNA 纯度及浓度检测:
完整性: RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE 电泳缓冲液;150v,15 分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于RNA 与蛋白反应交联会导致RNA 断裂或者降解,一般电泳后UV下只能看到模糊弥散(smear)带型,随着储存的时间越长,降解断裂越严重,甚至只能看到峰值仅仅在100bp 左右的模糊条带。这都属于RNA 提取正常情况。
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA,OD260/OD280 读数(10mMTris, pH7.5)在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品,假定在10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA 提取物,用RNase-free 水稀释n 倍,用RNase-free 水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260, OD280 测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
储存条件:室温,有效期9个月。
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