RFT114 JM110化学感受态细胞

JM110化学感受态细胞 细胞及免疫学

规格：20×100ul

编号：RFT114

品Pai：百奥莱博

产地：国产|进口

储存条件：-70℃冻存六个月

产品简介：本公司生产的JM1110感受态细胞采用经特殊工艺处理得到，可用于DNA的化学转化。使用pUC18质粒检测，转化效率可达108cfu/μg，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。

JM110菌株介绍：基因型：rpsL (Str R) thr leu thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm supE44 Δ(lac-proAB) /F′ [traD36 proAB lacIq lacZΔM15]

特点：1.JM 110 是一种甲基化基因dam、dcm 缺失的菌株，使DNA 不被甲基化，使用其转化所得到的质粒DNA，可被对dam、dcm 甲基化敏感的限制酶切割。

2.只适用于转化质粒DNA。

3.细胞具有硫酸链霉素(Strr) 抗性。

操作方法：（以下操作均按无菌条件的标准进行）

1取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。

以下实验以100 μl感受态细胞为例。

2 向感受态细胞悬液中加入目的DNA（50 μl的感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟。

3 将离心管置于42℃水浴中放置45秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。

4 向每个离心管中加入500 μl 无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素）， 混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

5将离心管内容物混匀，吸取100 μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12—16小时。

注：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200—300 μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4,000 rpm, 2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）

注意事项：1. 感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免感受态细胞的转化效率。

2. 进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。

3. 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到Z低。



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·T4 DNA ligase

编号：RFT116

规格：100U

T4连接酶

● 产品组成：名称 规格

T4 DNA ligase (5U/μl) 100 U (20μl)

10×T4 DNA Ligation Buffer 0.2 ml

50%PEG Solution 0.15 ml

● 保存：-20℃

● 产品简介：

T4 DNA Ligase 是从表达T4 DNA Ligase 基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化而来的，催化相邻DNA链的5’磷酸基团和3’羟基基团以磷酸二酯键结合反应。该酶可催化平末端或粘性末端DNA之间的连接，还可修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交双链中的单链切口。本品可应用于DNA插入片段和载体DNA的粘性末端和平末端的连接，以及线性DNA的自身环化。

活性定义：此酶的活力单位为Weiss Unit。1个Weiss Unit相当于约200个粘性末端连接单位（cohesive-end ligation unit, CEU）。1个CEU单位定义为在20 μl的连接反应体系中，在16℃30分钟内，能使50%的经HindIII消化的λDNA片段连接所需的酶量。

● 注意事项

1．T4 DNA Ligase的终用量不要超过推荐的用量，否则影响连接效率。

2．PEG可以极大提高平末端的连接效率，我们推荐加入终浓度为5% PEG Solution以提高平末端的连接效率。

3．为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。

4．由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深以免粘在枪头上造成损失。

● 使用方法：一 DNA片段和载体DNA的连接

1）粘性末端的连接

1．反应体系： 10μl体系 终浓度

线性载体DNA x μl 10-50 ng

插入DNA片段 y μl 插入片段：载体=1:1-5:1*

10×ligation buffer 1 μl 1×

T4 DNA ligase(5U/μl) 0.1 μl 0.5 U

ddH2O up to 10 μl

*：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。

2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。

3）在10 μl连接体系中若T4连接酶的终浓度大于1 U，必须对连接后的DNA片段进行纯化后方可进行电转。

2）平末端的连接

1．反应体系： 10μl体系 终浓度

线性平末端载体DNA* x μl 10-50 ng

插入DNA片段 y μl 插入片段：载体=1:1-5:1**

10×ligation buffer 1 μl 1×

T4 DNA ligase(5U/μl) 0.5 μl 2.5 U

50% PEG solution 1 μl 5%

ddH2O up to 10 μl

*：平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

**：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

注：1）由于平末端连接体系中，T4 ligase用量较大，若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯*(代"仿")抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。

二 线性DNA的自身环化

1．反应体系： 50μl体系 终浓度

线性载体DNA x μl 10-50 ng

10×ligation buffer 5 μl 1×

T4 DNA ligase(5U/μl) 1 μl 5 U

ddH2O up to 50 μl

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯*(代"仿")抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

三 接头连接

1．反应体系： 20μl体系 终浓度

线性DNA x μl 100-500 ng

磷酸化接头 y μl 1-2 μg

10×ligation buffer 2 μl 1×

50% PEG solution 2 μl 5%

T4 DNA ligase(5U/μl) 0.4 μl 2 U

ddH2O up to 20 μl

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。





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