人间充质干细胞成骨分化试剂盒

本产品仅适用于科研。
产品名称：人间充质干细胞成骨分化试剂盒
货号：CHEM-200001
批号：见包装
试剂清单：
存储与有效期：
A液于2-8℃避光保存，B-F液于-20℃避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8℃保存，有效期为2个月。
产品介绍(DESCRIPTION)
人间充质干细胞（hBMSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞ZL协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均对该三个指标进行了鉴定。
为方便科研用户鉴定MSC的分化能力，麒盟干细胞研究ZX精心优化hBMSC成骨诱导分化试剂盒，其中包括成骨诱导培养体系和鉴定所需要的染色液，让用户可以稳定有效地鉴定hBMSC的分化潜能。该试剂盒提供的实验方法为常规鉴定方法，用于鉴定hBMSC是否具有成骨分化能力。除此以外，试剂盒的诱导培养基还可用于诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。但若用于免疫荧光检测需注意钙沉积导致的自发荧光问题。
本产品仅适用于科研。
操作方法（METHODS& PROTOCOL）
实验准备
²  试剂配制：
室温融化C、D、E、F溶液，将融化的溶液加入A液中，然后将B液加入A液中，充分混匀。
注意：C、D、E液先于F液20分钟溶解、溶解后旋涡混匀、1000g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后，吸取A液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入A液中。所有液体混合成诱导完全培养基后必须充分混匀，2-8℃保存。整个过程需无菌操作，适当以75%酒精擦拭表面。
²  培养皿处理：
加适量明胶溶液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去明胶溶液 ，室温晾干。
注意：本试剂盒建议使用六孔板操作，每孔加明胶溶液1ml，使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作，避免污染。
²  自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  hBMSC完全培养基
l  4%中性固定溶液
注意：若hBMSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶YZ剂。hBMSC消化极易过度，建议稀释消化液一倍，且严格控制消化时间。
操作步骤
1.  准备所需诱导分化的hBMSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用hBMSC完全培养基重悬。
2.  按照4×10⁴cells/cm²的密度将细胞接种于已明胶处理的六孔板中，每孔hBMSC完全培养基2ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意：细胞密度为该试剂盒的标准密度，若修改细胞接种密度则需要考虑实验结果的稳定性。
3.  当细胞融合达60%时，弃去培养上清，每孔添加hBMSC成骨诱导分化完全培养基2ml/well，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意：成骨诱导后细胞极易脱壁，换液时完全培养基必须经37℃复温。添加培养基时动作要轻柔，避免吹起细胞。
4.  每3天更换新鲜的hBMSC成骨诱导分化完全培养基，持续培养2-4周。
注意：一般10天左右出现钙沉淀，培养液会较原先浑浊。根据需要可以选择培养终止时间，但不易超过4周。
5.  诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性固定溶液2ml/well室温固定细胞20分钟。
注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。
6.  弃去固定液，DPBS洗2次，加入茜素红染液1ml/well染色5分钟。
注意：该步骤适用于鉴定成骨能力，若出现钙沉积则会呈现红色着色。若需要得到美观的图片，则染色时间需自己掌握。
7.  弃去茜素红染液，DPBS洗3次。
8.  显微镜下观察并拍照。
9.  结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见红色着色点，此处为钙结节，说明实验所用的hBMSC具有成骨能力。否则，所使用的hBMSC无成骨能力。
结果展示



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