CRISPR/Cas9细胞株基因敲除细胞株构建

技术原理     

CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，此系统被成功改造为第三代人工核酸内切酶，用于基因组编辑的工具使用，利用该系统，我们可以进行各种复杂基因组的编辑。CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracr-RNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），以引导Cas9对DNA的定点切割。
 

实验案例

吉锐生物拥有完善的 CRISPR/Cas9 载体系统，包括单敲除，双敲除，缺口酶、慢病毒敲除载体和敲除载体库等体系。并且每一个载体系统都有不同的标签（EGFP/RFP/Puro/Neo）可供选择。同时，拥有 100 余种基因敲除的项目经验，可以快速、准确、GX的完成任何一个基因敲除的项目。
 

基因敲除细胞株构建

 服务流程

实验案例：

1、设计针对 Atg10基因的 gRNA并克隆到吉锐生物的 pGK1.1敲除载体中；
2、电转 pGK1.1（Atg10）载体至 K562细胞中；
3、Cruiser™酶切计算突变率（图1）；
4、单克隆筛选用 Cruiser™酶切验证获得潜在阳性克隆（图2）；
5、对潜在的阳性克隆进行测序验证，获得纯合子；

图1. Cruiser™酶切细胞池，计算突变率

图2. Cruiser™筛选单克隆细胞，获得潜在的阳性克隆。
 

图3. 潜在阳性克隆测序比对结果
 

根据潜在阳性克隆单克隆测序验证结果，判断该株疑似阳性克隆的两个亲本都缺失11bp碱基，该株阳性克隆为纯合子敲除细胞株。