BLOODmisi 全血（液体样本）微小RNA快速提取试剂盒

BLOODmisi 全血（液体样本）微小RNA快速提取试剂盒（ZP415）

近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15¬-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血液样本更是由于其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速直接裂解全血（液体样本）和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA,RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除， ZH低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

 

■ 产品特点

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。

3.独有的裂解液配方，可直接裂解全血，不需要先裂解去除红细胞。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

 

■ 适用范围

适用于快速提取各种全血/血浆/液体样本miRNA和其它各种小RNA

 

■ 储存事项

1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存一个月，如果要更长时间保存，请存放在4°C，但是使用前，应该先回复到室温。

2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

3.运输在常温下进行，不影响使用效果。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

■ 注意事项：
1. DY次使用前请先在Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入
指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式
离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3. 需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。
4. Lysis buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手
套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水
冲洗。
5. 预防RNase 污染，应注意以下几方面：
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不
含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M 
NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC
至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
6. RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳
缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后
UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相
当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中ZDrRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 
倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，
OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受
测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出
的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但
这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将
分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的
计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。05 06
BLOODmisi 全血（液体样本）微小RNA快速提取试剂盒
■ 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
→ 提示：DY次使用前请先在Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加
入指定量乙醇！
1. 每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml Lysis buffer，用加
样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75ml 
Lysis buffer。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一
倍后开始提取。Lysis buffer和液体样品的终体积比总是3：1。
2. 将样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
3. 每0.75ml Lysis buffer加0.2 ml氯仿，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。
4. 于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上
层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis buffer体积的70%。
5. 小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇
（必须是室温的），涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,
不要离心，立刻接下步。
6. 将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱
放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。
7. 加700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12，000rpm 
离心30秒，弃掉废液。
8. 加入500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 
rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl Wash Solution 2/3,重复一遍。
9. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免
漂洗液中残留乙醇YZ下游反应。
10. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜
的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水浴中预热效果更好）， 室
温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
11. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤11, 合并两
次洗脱液,或者使用DY次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1 
5–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。
附：微小RNA富集方法
1. 按照前面标准操作步骤1－4操作，直到得到上清。
2. 精确估计上清体积，加入1/3体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打
充分混匀，不要离心。
3. 将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心
30-60秒，收集滤过物。如果混合物大于700μl，则应该先加700μl离心，将滤过物从收
集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，
离心，合并两次滤过物，计算体积。
此时，滤过物含有微小RNA, 柱子上面是除去了微小RNA的总RNA，如果需
要，可以按照前面标准操作步骤7－10操作漂洗，洗脱回收得到去除了微小RNA的总
RNA。
4. 精确估计滤过物体积，加入2/3体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹
打充分混匀，不要离心。
5. 取一套新的离心吸附柱子RA, 将上一步骤混合物(每次小于700μl,多可以分两次
加入)加入吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。
6. 按照前面标准操作步骤7－10操作漂洗，洗脱得到富集的微小RNA。

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