Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶产品描述
HieffTM Pfu DNA Polymerase是经过基因工程改造的,新一代超保真DNA聚合酶,具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性,可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升,即使是非常复杂的模板,也能准确快速的完成反应。
本产品中附带的5 × Phanta SF反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1 × 终浓度为2 mM),可以使用产品中提供的DMSO或MgSO4对反应体系进行优化。另外,产品中附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。
产品特点:
• 保真度是Taq DNA Polymerase的52倍
• 扩增速度是常规聚合酶的4-150倍
• 广泛的模板适应性
• 优化的缓冲体系广泛适用于各种类型模板,便于快速得到理想的扩增结果
• 提供PCR Enhancer以帮助扩ZGGC含量的模板
• 提供即用型的预混液,ZD程度地减少实验步骤
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶产品组分
组分
产品编号/规格
10113ES76(100U)
10113ES76(500U)
5×SF Buffer(with 10 mM MgSO4)
1.25 ml
1.25 ml×5
25 mM MgSO4
1 ml
1 ml×5
dNTP Mix(10 mM each)
100 μl
100 μl×5
HieffTM Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)
100 μl
100 μl×5
5×PCR Enhancer
500 μl
500 μl×5
DMSO
100 μl
100 μl×5
10×Loading buffer
1.25 ml
1.25 ml×5
活性定义
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,74℃ 30分钟内,摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位(U)。
运输与保存方法
冰袋(wet ice)运输。收到产品后放到-20 ºC保存。
质量控制
核酸外切酶残留检测:10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。核酸内切酶残留检测:10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中,加入2U本品,以ddH2O为模板,扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,无扩增条带。
功能检测1:50 μl PCR体系中加入1U本品,以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2:50 μl PCR体系中加入1U本品,以10 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环,取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的15 kb条带。
引物设计注意事项
1)引物3’端ZH一个碱基为G或者C;
2)引物3’端ZH8个碱基应避免出现连续错配;
3)引物3’端尽量避免发夹结构出现;
4)引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5)引物额外附加序列,即与模板非配对序列,不应参与引物Tm值计算;
6)引物的GC含量控制在40%-60%之间;
7)正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
应用实例
1.反应体系配制:
所有操作请在冰上进行,各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HieffTM Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶ZH加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5 × SF Buffer请勿长时间敞口放置。
ddH2O
to 50 μl
5×SF Buffer(with 10 mM Mg SO4)
10 μl
25 mM MgSO4a
optional
dNTP Mix(10 mM each)b
1 μl
DMSOc
optional
5×PCR Enhancerd
optional
模板DNAe
optional
引物1(10 μM)
2 μl
引物2(10 μM)
2 μl
HieffTM Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f
1 μl
注:a. 对于大多数PCR反应,Mg2+ZJ终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+,如有需要,可用25 mM MgSO4,以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+ZJ使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用;可能会降低保真度。
e. 不同模板ZJ反应浓度有所不同,下表为50 μl反应体系推荐模板使用量:
模板种类/扩增长度
<1 kb
1 kb~10 kb
>10 kb
基因组DNA
50 ng~250 ng
100 ng~300 ng
150 ng~400 ng
质粒或病毒DNA
10 pg~20 ng
10 pg~20 ng
1 ng~30 ng
cDNA
1~5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)
f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而,根据扩增子的长度和复杂程度不同,可将HieffTM Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。HieffTM Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆,加A之前必须进行DNA纯化。
2. 一般PCR反应条件设置:
循环步骤
温度
时间
预变性a
95℃
30 sec~3 min
变性b
95℃
5~10 sec
25~35循环
退火c
45℃~72℃
10~30 sec
延伸d
72℃
15~30 sec/kb
彻底延伸
72℃
5~10 min
注:a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃, 时间为:质粒或病毒DNA,30 sec,基因组2 min,cDNA 3 min;对于高GC含量模板,预变性温度需提升至98℃,变性时间为2~4 min;对于超过10 kb的扩增子,预变性温度需降低至92℃,变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5~10 sec即可。对于高GC含量模板,变性温度需提升至98℃;对于超过10 kb的扩增子,变性温度需降低至92℃,并延长变性时间至15 sec。
c. HieffTM Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物GX退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此,推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板,退火时间可在10~30 sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段,需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时,可使用15 sec/kb的延伸时间;使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时,延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加,因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。
3. 长片段PCR指南:
*使用高质量的模板;
*使用长引物。将引物加长至Tm值68~72℃,把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性;
*适当提高酶量,但50 μl反应体系内不要超过2 U;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~6%;
*推荐反应条件设置:
循环步骤
温度
时间
预变性
92℃
2 min
变性
92℃
5~10 sec
25~35循环
延伸
68℃
15~30 sec/kb
彻底延伸
68℃
5~10 min
4. 高GC含量模板PCR指南:
*使用高质量的模板;
*提高变性温度至98℃;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~8%;
*添加5 × PCR Enhancer;
*推荐反应条件设置:
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶循环步骤
温度
时间
预变性
98℃
3 min
变性
98℃
10 sec
25~35循环
退火
45℃~72℃
10~30 sec
延伸
72℃
15~30 sec/kb
彻底延伸
72℃
5~10 min
5. PCR反应体系优化方案实例(使用新引物初次扩增目标片段时可参照下述方法优化反应体系):
对于常规PCR反应,引物浓度、dNTP浓度、酶浓度、模板浓度、Mg2+浓度可不做特别调整,使用前述一般推荐用量即可。当使用新引物初次扩增目标片段时,可使用随酶提供的两种添加剂 (DMSO、5 × PCR Enhancer)对反应体系进行初步优化。多数目标片段通过这一优化即可建立良好的扩增体系。下面以人基因组为模板扩增6 kb片段为例 (引物退火温度59.2℃),推荐实验方案为:
ddH2O
Up to 20 μl
5×SF Buffer(with 10 mM MgSO4)
4 μl
dNTP Mix(10 mM each)
0.4 μl
模板DNA
100 ng
引物1(10 μM)
0.8 μl
引物2(10 μM)
0.8 μl
HieffTM Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)
0.4 μl
DMSO
0.6 0 0.6 0 μl
5×PCR Enhancer
0 4 4 0 μl
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶yb-axbz-135 蝙蝠肺细胞 Tb 1 Lu 规格25毫升/株.
yb-axbz-136 小鼠B细胞杂交瘤细胞 W6/32 规格25毫升/株.
yb-axbz-137 鼠纤维肉瘤细胞系 WEHI 164 规格25毫升/株.
yb-axbz-138 小鼠B淋巴细胞 WEHI 231 规格25毫升/株.
编号 中文 英文名称 规格25毫升/株.
yb-axbz-139 大鼠垂体细胞 RPC 规格25毫升/株.
yb-axbz-140 小鼠垂体细胞 MPC 规格25毫升/株.
yb-axbz-141 兔子垂体细胞 规格25毫升/株.
yb-axbz-142 狗垂体细胞 规格25毫升/株.
yb-axbz-143 鼠肝癌细胞系 MM45T.Li 规格25毫升/株.
yb-axbz-144 小鼠成纤维细胞系 McCoy 规格25毫升/株.
yb-axbz-145 大鼠肝癌细胞(乳腺癌细胞接种到肝脏成瘤) Walker-256 规格25毫升/株.
yb-axbz-146 大鼠肝癌细胞(wistar 大鼠) CBRH7919 规格25毫升/株.
yb-axbz-147 小鼠结肠癌 C26 规格25毫升/株.
yb-axbz-148 稳定转染了neor和LIF基因的STO细胞株 SNL 规格25毫升/株.
yb-axbz-149 小鼠艾氏腹水瘤细胞 ECA 规格25毫升/株.
yb-axbz-150 褐鼠胰岛素瘤上皮细胞 RIN-m 规格25毫升/株.
yb-axbz-151 小鼠杂交瘤细胞 ST2/o 规格25毫升/株.
yb-axbz-152 小鼠肾癌细胞 RenCa 规格25毫升/株.
yb-axbz-153 小鼠胰岛素瘤β细胞(NOD/Lt转基因小鼠,SV40巨T抗原) NIT-1 规格25毫升/株.
yb-axbz-154 早代小鼠胚胎成纤维细胞 MEF 规格25毫升/株.
yb-axbz-155 ZG仓鼠肺细胞 V79 规格25毫升/株.
yb-axbz-156 兔的肝细胞 VX2 规格25毫升/株.
yb-axbz-157 鸡胚原代肝细胞 CEL 规格25毫升/株.
yb-axbz-158 129小鼠ES细胞 D3 规格25毫升/株.
yb-axbz-159 129小鼠ES细胞 E14 规格25毫升/株.
yb-axbz-160 BALB/c小鼠ES细胞 B/c-ES 规格25毫升/株.
yb-axbz-161 猴的间充质干细胞 MSCS 规格25毫升/株.
yb-axbz-162 SD大鼠间充质干细胞 SDBMSC 规格25毫升/株.
温馨提示:不可用于临床ZL。