上海-天青石蓝B染色液

上海-天青石蓝B染色液

适用范围

组织学、胚胎学、病理学教学与科研。

原理

易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性(
acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。

组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。

脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。上海-天青石蓝B染色液

由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。 [1] 

试剂与仪器

A：0.5~1%
的伊红酒精溶液：

称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。上海-天青石蓝B染色液

B：苏木素染液配方：(配制3000
ml，可按比列减少)

苏木精6
g

无水乙醇100 ml

硫酸铝钾150 g

蒸馏水2000
ml

碘酸钠1.2
g

冰醋酸 120 ml

甘油 900 ml

配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。 [2] 

操作步骤

常规he染色步骤

(1)二甲苯（Ⅰ）
15min

(2) 二甲苯（Ⅱ） 15
min

(3)二甲苯：无水乙醇=1:1
2min

(4) 乙醇（Ⅰ）
5min

(5) 乙醇（Ⅱ） 5
min

(6) 80%乙醇
5min

(7) 蒸馏水 5
min

(8) 苏木精液染色 5
min

(9) 水洗10
min 或流水冲洗5 min

(10) 1%盐酸乙醇 30s

(11) 水洗 30
s

(12)蒸馏水过洗 5 s

(13) 0.5%伊红液染色 1-3
min

(14) 蒸馏水稍洗 30
s

(15) 80%乙醇稍洗 30
s

(16) 95%乙醇（Ⅰ）1
min

(17) 95%乙醇（） 1
min

(18) 无水乙醇 （Ⅰ）3 min

(19)无水乙醇（Ⅱ）3
min

(20)二甲苯（Ⅰ） 3
min

(21)二甲苯（Ⅱ） 3
min

(22)中性树胶封固

冷冻切片HE染色步骤

（1）冰冻切片固定 10～30 s

（2）稍水洗 1～2 s

（3）苏木精液染色（60℃） 30～60 s

（4）流水洗去苏木精液 5～10 s

（5）1%盐酸乙醇 1～3 s

（6）稍水洗 1～2 s

（7）促蓝液返蓝 5～10 s

（8）流水冲洗 15～30 s

（9）0.5%曙红液染色 30～60 s

（10）蒸馏水稍洗 1～2 s

（11）80%乙醇 1～2 s

（12）95%乙醇 1～2 s

（13）无水乙醇 1～2 s

（14）石炭酸二甲苯 2～3 s

（15）二甲苯（Ⅰ） 2～3 s

（16）二甲苯（Ⅱ） 2～3 s

（17）中性树胶封固。 [1] 

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

注意事项

切片脱水透明
切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石炭酸二甲苯进行脱水。石炭酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。 [3] 

结果的判断

实验结果

细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。 [1] 

着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

H-E染色评定标准：

（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；

（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。 [4] 

苏木素和伊红在组织学上被经常使用，与碘液不同，这是一种染色剂。其他常用的含有苏木素的染色剂有磷钨酸苏木素染色剂，也就是磷钨酸与苏木素的混合物。

苏木素染色剂经常为组织的研究使用。 明矾和三价铁盐常常被用作媒染剂，展示核和细胞质结构。这些媒染剂的原理都是形成媒染剂－染料－组织复合体，从而显示颜色。使用的盐不同颜色也不同： 当用铁盐呈现深蓝色颜色沉淀，用铝盐通常显示蓝白色。下面分别介绍铝苏木素溶液和铁苏木素溶液。 [2] 

编号系统

CAS号：517-28-2

MDL号：MFCD00005394

EINECS号：208-235-2

RTECS号：暂无

BRN号：112676

PubChem号： [3] 

历史

在20世纪70年代，由于巴西热带雨林被大量砍伐，洋苏木大量减少，苏木素的产量随即大量减少。苏木素的价格上升惊人，因而大大提高了组织病理学诊断的成本，引起了寻找苏木素替代品的高潮。不过，在各种苏木素的替代品的地位真正确立之前，苏木素又重返市场，又在组织病理学诊断中发挥其重要作用。到2013年为止，几种推荐使用的替代染剂有铬天青、焙花青、茜素紫（又名焦没食子酚酞、棓因)。这些染料都用三价铁离子作为媒染剂。焙花青还可以用铬矾作媒染剂。 [4] 

铝溶液

常用的两种铝苏木素溶液有Ehrlich氏溶液和Harris氏溶液。铝苏木素溶液能够把细胞核染成半透明的浅蓝色，在酸性环境下会迅速变成红色。作为媒染剂使用的钾铝硫酸盐在碱性溶液通常结合与氢氧根形成不能溶解的氢氧化铝。
在过量的酸中，氢氧化铝由于缺乏OH-离子而溶解,因此,铝苏木素溶液的酸性溶液变成红色。 在铝苏木素溶液染色时，被染色的部分通常转移到一种碱性溶液中，中和酸并释放氢氧根，形成一个不溶的蓝色铝苏木精复合物。

由于自来水碱性不十分强，通常用每升含有33.5 g NaHCO4和20克的MgSO4，并加入百里香酚兰的溶液代替。使用冷水会减慢染色过程。 实际上，使用在10°C之下的冷水甚至可能导致组织呈现红色。 [2] 

Ehrlich

1 g 苏木素

100 ml无水乙醇

60 g 明矾(铝钾硫酸盐)

100 ml甘油

100 ml蒸馏水

10 ml冰醋酸(HOAc)

首先，在100 ml无水乙醇中溶解1 g 苏木素，微热。 然后，在100
ml蒸馏水中溶解60 g明矾加入100
ml甘油微热。 第三步，混合二种溶液并且增加10
ml冰醋酸。 然后转移到用棉花轻轻塞住口的烧瓶中，暴露在空气和阳光中几个星期，每天震荡溶液。在这个过程中，苏木素被部分氧化。 后，把溶液转移到一个封口很严的试剂瓶中在温暖处存放。

染色时，有时需要加入0.3 g碘酸钠。
因为苏木素溶液被氧化，溶液的颜色从紫色将变成深红，而醋酸刺激性气味将变成宜人的芳香。 甘油作为稳定剂并且减速溶液的蒸发。 然而，甘油可以减速染料的成熟，所以可以在初的制备以后的4到6个星期后加入。

Ehrlich的苏木素溶液染色时，黏多糖物质例如软骨素也被染成蓝色。 染色时间通常是15到40分钟。 [2] 

Harris

1 g 苏木素

10 ml无水乙醇

20 g 明矾(铝钾硫酸盐)

190 ml蒸馏水

10 ml冰醋酸(HOAc)

首先，在10 ml无水乙醇中溶解1 g 苏木素，微热。 然后，在500
ml烧杯中加入190ml蒸馏水和20 g明矾。 第三步，加入氧化gong，立即插入冷水中迅速降温。要用开口较大的容器，防止加入氧化gong后放出氧气引起爆炸。加入氧化gong后，溶液应该呈现深紫色。加入4%的l冰醋酸能够使对细胞核染色的特异性更强。 后，把溶液过滤，转移到一个密封的试剂瓶中，立即使用或长期保存。

Harris氏苏木素配方染色被用于细胞核的常规检查和性染色体的检查。染色时间通常是5到20分钟 [2] 

Cole

1.5 g 苏木素

50 ml1%的碘的95%乙醇溶液

700ml饱和的明矾溶液

250 ml蒸馏水

把苏木素溶解到250ml温的蒸馏水中，加入碘酒，加入明矾溶液，煮沸。

Cole氏苏木素染色溶液使用前要冷却，过滤。染色时间通常是10分钟。 [5] 

Mayer

比Ehrlich氏苏木素配方灵敏度好，不会或很少会把黏多糖物质染色。

1 g 苏木素

0.2g NaIO3

50g 明矾

1g柠檬酸

50g水合三氯乙醛

1000 ml蒸馏水

把苏木素,明矾，碘酸钠加入1000ml蒸馏水溶解，过夜放置，以便苏木素充分溶解。加入柠檬酸，水合氯醛，煮沸5分钟后冷却。 [5] 

铁溶液

常用的两种铁苏木素溶液有Weigert氏溶液（使用氯化铁铵作为媒染剂）和Heidenhain氏溶液（使用硫酸铁铵作为媒染剂）。它们都是活泼的氧化剂，不能长期保存。铁苏木精溶液能够用于几乎所有的固定剂，而且如果用于媒染的过量的铁离子都被冲洗净的话，能够着色。在酒精中浸泡多年的组织往往不易着色，这时就可以选择铁苏木素染色，效果很好。铁苏木素溶液会把细胞核染成灰黑色，常常用于显微照相。 [5] 

Weigert

Weigert氏苏木素配方是实验室使用的标准铁苏木素溶液，特别是在染色显示肌纤维时。当使用的生物材料或已经用过的试剂中含有酸时，适合使用的就是Weigert氏苏木素溶液，因为这时所有的铝苏木素溶液染细胞核时都会褪色。

A液

1g苏木素

100ml无水乙醇

B液

4ml 30%无水氯化铁溶液

1ml浓盐酸

100ml蒸馏水

在酒精中溶解苏木素，微热。在另一个容器中混合盐酸、氯化铁和蒸馏水。两种溶液都很稳定，可以放置6个星期不变质。染色前，把两溶液等量混合，得到深黑色混合液，即可染色。混合液可以保存1~2天。

Heidenhain

Heidenhain氏苏木素配方用于细胞学染色观察，特别是用于一些较薄的组织的回染。它可以用于细胞核的染色观察，能够清楚地显示染色体、染色质以及细胞质中线粒体的位置。此外，还可以使髓鞘染色。

染色剂：

0.5 g 苏木素

10 ml 95%乙醇

90 ml蒸馏水

媒染剂：

25 g 硫酸铁铵

100 ml蒸馏水

把染色剂和媒染剂分开配制，放置4～5星期成熟。染色时再混合。 [5] 

磷钨酸

1g苏木素

20g磷钨酸

1000ml蒸馏水

用多份水分别溶解溶质，然后再混合起来。光照下放几个星期成熟。加入0.177g钾可以立即成熟。

配好后，染色剂的颜色为红棕色到紫色。染色时，细胞核，肌动纤维为蓝色，骨骼、软骨为橘红色、红棕色直到深砖红色。由于染色是逐步进行的，所以每小时显微镜观察一次。酒精可以洗去红色，因此，冲洗时间要短。染色时间是12~24小时。