LncRNA芯片技术服务

    长链非编码RNA (LncRNA) 是一类长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明：LncRNA广泛参与各种生物学过程，LncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种疾病密切相关。通过LncRNA芯片，研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的LncRNA的表达变化，从而为后续的LncRNA功能研究或生物标志物筛选提供极大的便利。

    Arraystar LncRNA芯片可同时检测LncRNA和mRNA，这一突破性芯片平台的构建，使Arraystar成为LncRNA研究领域的先驱和。迄今为止，采用Arraystar LncRNA芯片已发表的SCI论文已超100篇，其中多篇发表在Cancer Cell，Mol Cell，Hepatology，Blood，EMBO等国际DJ杂志上。
 

 

1. 样品总RNA抽提
    若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
若实验对象为细胞样品，每份样品取1×10⁶~1×10⁷细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
2. RNA质量检测
    使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性
3. cDNA样品合成和标记
4. 标记效率质量检测
    使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。
5. 芯片杂交
    在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。
6. 图像采集和数据分析
    使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
7. 提供实验报告
    芯片扫描图
    实验方法中英文报告
    RNA质检报告
    芯片数据结果报告，包括差异表达LncRNA列表，差异表达基因列表

               常规lncRNA芯片研究流程

 

    对于每个实验组有三次及三次以上生物学重复的实验设计，我们应用T检验筛选任意两个实验组之间差异表达的LncRNA，方差分析（ANOVA）则用于从三个以上实验组筛选差异表达的LncRNA，并以邻近（<100kb）mRNAs进行注释。康成生物除了提供常规的通过p值筛选的差异LncRNA，还提供通过   FDR筛选的差异LncRNA。与p值筛选相比，FDR筛选对多重筛选过程中的假阳性率进行控制，是一种更加严谨的筛选方法，更适合于生物学重复较多的临床样本。

    适用范围：一般用于两组或多组实验状态下的比较，建议每组实验至少有3次生物学重复。

 

    为了全面而直观地展示样品之间的关系及基因表达差异情况，将表达基因做层次聚类分析。用挑选的基因的表达情况来计算样品直接的相关性。一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇（Cluster）中，聚在同一个簇的基因可能具有类似的生物学功能。

     适用范围：两组或多组样品的表达谱数据

 

    很多LncRNA是通过调控邻近发挥生物学功能，因此通过邻近基因的分析可以为后续LncRNA的功能研究提供线索。康成生物将差异LncRNAs数据与其临近（< 100 kb）mRNAs的差异表达数据整合，以期提供LncRNAs的功能推断。

    适用范围：两组或多组数据比较获得的差异LncRNA

     Gene Ontology（简称GO）是基因功能国际标准分类体系。GO可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（Biological Process）和细胞组成（Cellular Component）三个部分。康成生物对位于差异LncRNA附近（< 100 kb），并且差异表达的蛋白编码基因进行了GO分析。这一方面便于客户从整体上了解差异LncRNA所涉及的GO条目，另一方面也为客户挑选LncRNA提供了线索：客户可以挑选与感兴趣的GO条目相关的差异LncRNA进行后续研究。

 

    康成生物对位于差异LncRNA附近（< 100 kb），并且差异表达的蛋白编码基因进行了Pathway分析。这一方面便于客户从整体上了解差异LncRNA所参与的信号通路，另一方面也为客户挑选LncRNA提供了线索：客户可以挑选与感兴趣的信号通路有关的差异LncRNA进行后续研究。

    在LncRNA中，研究得比较深入的是反义（Antisense） LncRNA，有超过30%的已注释的人类转录本有相应的反义LncRNA。这些反义LncRNA通过多种机制在转录水平或转录后水平调控相应的正义（sense）mRNA，从而发挥生物学功能。如下图中反义LncRNA诱导染色质和DNA的表观遗传改变，从而影响相应的正义mRNA的表达。康成生物将差异antisense LncRNAs与相应的sense mRNAs信息进行整合，以推断LncRNAs的功能.

 

*图释：反义LncRNA诱导染色质和DNA的表观遗传改变，从而影响相应的正义mRNA的表达。

 

 

    LncRNA可以发挥类似增强子的功能，增强邻近蛋白质编码基因的表达，从而在发育和分化等过程中发挥关键作用。康成生物对Ørom UA等人在人类细胞系中发现的3千多条具有增强子功能的LncRNA 进行了详细的注释，并将差异的Enhancer LncRNAs与相应的mRNAs(<300kb)进行了整合，以帮助客户推断这些LncRNAs的功能。

*图释：LncRNA作为增强子，增强邻近蛋白质编码基因表达水平；下图：经siRNA敲除ncRNA后，邻近蛋白质编码基因表达水平下降

 

 

    lincRNAs是目前研究的热点之一。康成生物根据Rinn等构建的lincRNAs数据库，将芯片中符合标准的差异LncRNA挑选出来与相应mRNA（< 300 kb）进行联合分析，以推断lincRNA功能。

 

康成生物还可以根据客户要求，提供更加深入的高级数据分析。

    CNC分析是一种通过LncRNA和mRNA共表达数据，将LncRNA与mRNA联系起来的分析方法。通过CNC分析可以发现与某个LncRNA具有相同表达模式的mRNA，通过这些mRNA的功能，可以将LncRNA与特定信号通路或疾病状况联系起来，从而便于预测LncRNA的功能，并揭示其作用机制。

    适用范围：芯片数量≥6张

    康成生物CNC分析结果展示，下图数据来源于康成客户已发表的文献（Hepatology，影响因子：12.003）：

*图释：LncRNA-HEIH在HCC中的共表达网络。黄色的节点代表LncRNA，绿颜色的节点代表与肿瘤生长和药物耐受相关的蛋白编码基因，紫色节点代表功能未知的蛋白编码基因。

 

    康成生物还为客户提供包括课题设计到ZZ数据分析在内的一站式biomarker分析，以最常见的筛选预后biomarker为例，我们首先通过Cox回归模型筛选预后相关的LncRNA，然后通过Logistic regression，Nearest Template Prediction (NTP)等多种统计学方法构建预测模型，然后从中挑选出效果的预测模型用于后续分析。无论是LncRNA的筛选，还是预测模型的建立，都及其严谨和科学，能ZD限度的为客户发表文章提供帮助。

 

康成客户实例——Arraystar LncRNA表达谱芯片
Repression of the long noncoding RNA-LET by histone deacetylase 3 contributes to hypoxia-mediated metastasis. Molecular Cell. 2013.
使用芯片： Arraystar Human LncRNA Microarray
    研究者通过 Arraystar Human LncRNA芯片筛查到了在肝细胞癌中特异性低表达的LncRNA分子（LncRNA-LET），并在大规模临床样本中利用实时定量PCR实验发现该LncRNA分子在肝细胞癌、结肠癌和鳞状细胞肺癌中都有特异性低表达；进一步的研究表明该LncRNA的显著下调由缺氧性组蛋白脱乙酰化酶3介导，并通过调节NF90蛋白影响癌细胞转移。本研究首次在分子机制的角度阐述了缺氧、组蛋白乙酰化、LncRNA分子和癌细胞转移之间的关系，找到了新的影响癌细胞转移的ZL靶点，有着重大的生物和临床意义。

HBx-related lncRNA Dreh inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin. Hepatology. 2012.
使用芯片：Arraystar Mouse LncRNA Microarray
    研究人员利用Arraystar Mouse LncRNA芯片在HBx转基因小鼠肝脏中筛选出差异表达的LncRNA，其中LncRNA.Dreh (AK050349)表达量在所有年龄和性别的转基因小鼠中都显著下调。对LncRNA.Dreh进行深入研究发现，LncRNA.Dreh能结合中间丝蛋白并YZ其表达，通过改变细胞骨架结构和形态，YZ癌细胞的增殖和转移。对50例临床样本(肝癌组织v.s.癌旁组织)的研究发现：该分子在癌组织中表达量比正常组织低，并且和病人的预后相关，LncRNA.Dreh表达量高的病人复发率低并且生存期长。该研究首次将乙肝病毒自身表达的HBx蛋白和肝脏组织中的LncRNA关联起来，找到了新的肝癌预后标志物，有着重大的临床意义。

Long non-coding RNA high expressed in hepatocellular carcinoma (LncRNA-HEIH) facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2. Hepatology. 2011
使用芯片： Arraystar Human LncRNA Microarray
    研究者首先通过LncRNA芯片实验和RT-PCR验证，在5例肝癌组织与5例癌旁组织样本中找到了一个肝癌细胞高表达的LncRNA（LncRNA-HEIH），并且在大量样本（50例肝癌和正常组织，20例肝硬化组织和正常肝组织）验证了LncRNA-HEIH的特异性。通过基因共表达网络图和病人生存时间等临床数据关联分析，发现LncRNA-HEIH可以作为一个独立的判断HCC病人生存时间的预后指标。一般LncRNA-HEIH表达越高，HCC病人的预后越差。然后研究人员对LncRNA-HEIH的功能展开了深入的研究。首先利用过表达技术（gain of function ）和RNAi技术（loss of fuction）发现LncRNA-HEIH能促进细胞增殖，在细胞周期调控过程中起重要作用。RNA免疫共沉淀和ChIP等实验揭示了LncRNA-HEIH可以通过结合EZH2招募PRC2，进而YZ下游靶基因的表达，实现调控细胞周期的功能。这些结果提示在肝细胞癌症发生过程中，LncRNA-HEIH可能是一个重要的调控“枢纽”。

上图：肝癌（n=5）和癌旁组织（n=5）的芯片聚类结果。Arraystar公司的lncRNA芯片同时设计了mRNA与lncRNA，图A为差异表达的254个mRNA聚类结果，图B为差异表达的174个lncRNA聚类结果。红色代表上调，绿色代表下调。