细胞基本技术(上海酶研发布)冻存细胞的复苏 - 应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。
- 在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养。
传代:对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱(或PBS洗1-3次)。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml,按此比例进行消化,(根据经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验。一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离心1000rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。
冻存
将贴壁细胞消化后离心收集,悬浮细胞直接离心收集,以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1~2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 支原体污染及检测:
(1).支原体污染在细胞培养中Z常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的Z小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,Z小直径0.2um,可通过滤器。
支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来YZ细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行实验研究时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。
上海酶研生物细胞经过严格质控,不含有细菌、真菌、病毒(HIV、HBV、HCV)、支原体。 (2).支原体污染后,培养基可不发生浑浊,细胞病变轻微或不明显,因此难以发现。目前,支原体检测的方法有以下几种。
(a).相差显微镜观察;
(b).低张处理地衣红染色法;
(c).荧光染色法;
(d).酶标法;
(e).PCR法:基础医学细胞ZX使用该方法进行检测。
优点:灵敏度高,检测耗时短,样品量小
(只需50ul细胞培养用液上清)。
缺点:引物及制剂费用较高。
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