肝癌 SMMC-7721

【摘要】  　　　　Induction of differentiation of hepatocarcinoma SMMC7721 cells by triazole schiff base derivative

　　MA YongChao, HUANGFU ChaoShen, HU GuoQiang, YANG RuiSheng, LIU Bin

　　1Institute of Neurobiology, 2Institute of Pharmacology, Henan University, Kaifeng 475004, China

　　【Abstract】 AIM: To study the effect of 3pyridin3yl4［（4hydroxy3methoxybenzylidene）amino］5methylsulfanyl4H［1,2,4］ triazole (LH37) on the induction of differentiation of hepatocarcinoma SMMC7721 cells. METHODS: SMMC7721 cells were cultured in RPMI1640 and treated by LH37 at different doses. The proliferation of the cells was examined by MTT assay. Cell morphology was observed by light microscopy. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the changes of alpha fetoprotein (αFP) mRNA. The specific activities of alkaline phosphatase (ALP) were assayed by ALP kit based on Kings method. RESULTS: The cell proliferation was inhibited by LH37 at 1×10-5-1×10-3 mol/L in dose dependent manners. 1×10-5 mol/L LH37 induced the morphological normality of SMMC7721 cells. After treated with 1×10-5 mol/L or 1×10-6 mol/L LH37, the mRNA expression of αFP was significantly reduced and the activities of ALP were remarkably declined (P<0.01). CONCLUSION: LH37 may inhibit proliferation and induce differentiation of human hepatocarcinoma SMMC7221 cells.

　　【Keywords】 triazole schiff base derivative；hepatocarcinoma；cell proliferation; cell differentiation

【关键词】  三氮唑席夫碱衍生物； 肝细胞癌； 细胞增殖； 细胞分化

　　Induction of differentiation of hepatocarcinoma SMMC7721 cells by triazole schiff base derivative

　　MA YongChao, HUANGFU ChaoShen, HU GuoQiang, YANG RuiSheng, LIU Bin

　　1Institute of Neurobiology, 2Institute of Pharmacology, Henan University, Kaifeng 475004, China

　　【Abstract】 AIM: To study the effect of 3pyridin3yl4［（4hydroxy3methoxybenzylidene）amino］5methylsulfanyl4H［1,2,4］ triazole (LH37) on the induction of differentiation of hepatocarcinoma SMMC7721 cells. METHODS: SMMC7721 cells were cultured in RPMI1640 and treated by LH37 at different doses. The proliferation of the cells was examined by MTT assay. Cell morphology was observed by light microscopy. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the changes of alpha fetoprotein (αFP) mRNA. The specific activities of alkaline phosphatase (ALP) were assayed by ALP kit based on Kings method. RESULTS: The cell proliferation was inhibited by LH37 at 1×10-5-1×10-3 mol/L in dose dependent manners. 1×10-5 mol/L LH37 induced the morphological normality of SMMC7721 cells. After treated with 1×10-5 mol/L or 1×10-6 mol/L LH37, the mRNA expression of αFP was significantly reduced and the activities of ALP were remarkably declined (P<0.01). CONCLUSION: LH37 may inhibit proliferation and induce differentiation of human hepatocarcinoma SMMC7221 cells.

　　【Keywords】 triazole schiff base derivative；hepatocarcinoma；cell proliferation; cell differentiation

　　0 引言

　　三氮唑类衍生物具有YZ肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化的作用［1-2］，但含杂环席夫碱类的该衍生物目前少见报道. 经结构修饰，我们得到了新的三氮唑席夫碱衍生物-LH37. 本研究利用人肝癌SMMC7721细胞株，初步探讨该化合物对癌细胞增殖和诱导分化的影响，希望获得能够诱导肿瘤细胞分化的候选物，为进一步开发和应用提供依据.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 诱导剂LH37是具有1，2，4三氮唑骨架结构的3吡啶3基4［（4羟基3甲氧基苯亚甲基）氨基］5甲硫基1，2，4三唑（图1），由河南大学药物研究所提供. 纯度>99%，二甲基亚砜（DMSO）溶解.

　　1.1.2 细胞株和主要试剂

　　肝癌细胞株SMMC7721（ZG医学科学院基础医学研究所）生长在含100 mL/L胎牛血清（天津灏洋生物制品公司）的RPMI 1640培养基（ Gibco公司）中.四甲基偶氮唑蓝（MTT），MMLV逆转录酶，Oligo(dt)15和RNasin (Promega公司)；DMSO (Solarbi公司)；维甲酸（RA）(美国Sigma公司)；金氏法碱性磷酸酶检测试剂盒(北化康泰试剂有限公司). 其余试剂为国产分析纯.

　　1.1.3 引物合成甲胎蛋白(αFP)和βactin引物序列引自文献［3，4］， 均由上海生工生物工程公司合成.

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT试验

　　细胞以1×104/L接种到96孔细胞培养板，0.2 mL/孔，继续培养24 h后换液，同时加入LH37. LH37按倍比稀释方式加入，浓度为1.024×10-3 mol/L，浓度为1.6×10-5，共7个浓度梯度（每个浓度5个复孔），对照组只加培养液. MTT试验按照文献［5］的方法进行.

　　1.2.2 形态学观察

　　SMMC7721细胞以1×105/L浓度接种于含盖玻片的6孔培养板中培养24 h，1×10-5 mol/L LH37处理细胞96 h后取出盖玻片，瑞氏染色，显微镜观察，对照组只加培养液.

　　1.2.3 αFP mRNA表达检测

　　SMMC7721细胞培养至对数生长期加入各种药物，其中用1×10-5 mmol/L RA作为阳性对照；用DMSO（与LH37等体积）排除溶剂的干扰作用；LH37选用1×10-5 mol/L和1×10-6 mol/L两个浓度；阴性对照组不加药. 继续培养48 h弃去培养液，采用异硫氰酸胍酸性酚氯仿抽提法提取总RNA. 逆转录合成cDNA链，直接用于PCR扩增. 人αFP上下游引物序列分别为5′ATTCAGACTGCTGCAGCCAA3′和5′GTGCTCATGTACATGGGCCA3′,PCR产物为475 bp. βactin上下游引物序列分别为5′GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC3′和5′TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT3′，PCR产物为516 bp. 反应条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s,共进行35个循环.

　　1.2.4 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定

　　细胞按1×104/L浓度接种， 培养24 h后各组细胞分别按1×10-6 mol/L和1×10-5 mol/L浓度加入LH37，阳性对照组按1×10-5 mol/L浓度加入RA，继续培养48 h后消化并收集细胞，按每1×106个细胞加放射免疫沉淀裂解液（RIPA） 2 mL，剧烈振荡30 s，转移入2 mL EP管. 4℃ 12 000 g离心20 min，吸取上清液，考马斯亮蓝G250法定蛋白浓度，按试剂盒操作步骤检测ALP活性，每组重复测定3次.

　　统计学处理： 数据均用x±s表示， 应用SPSS 12.0软件包处理, P<0.05为差异具有统计学意义. 所用统计分析方法有单因素方差分析（多重比较采用Dunnett检验），成组t检验.

　　2 结果

　　2.1 LH37对SMMC7721细胞增殖的YZ作用

　　不同浓度LH37作用48 h对肝癌细胞具有增殖YZ作用，YZ率与药物浓度正相关（相关系数0.9052），呈剂量依赖关系， IC50为2.0×10-4  mol/L， IC30为6.9×10-5  mol/L（表1）.表1MTT比色法检测LH37对SMMC7721细胞增殖的影响(略)

　　2.2 LH37对SMMC7721细胞形态变化的影响

　　对照组SMMC7721细胞贴壁生长良好, 并有肿瘤细胞的典型形态，细胞间相互连接，密集成片生长，细胞核大，核浆比大，有3~6个核仁，细胞浆内无空泡（图2A）. LH37 (1×10-5 mol/L)处理组作用48 h后可见部分细胞脱落, 贴壁细胞浆内颗粒多,表现为细胞体积变小，呈三角形、梭形或多边形，核明显变小，核浆比减少，核仁1~2个,胞浆有圆形空泡，呈现向正常细胞形态逆转演变的特征(图2B).

　　2.3 LH37对SMMC7721细胞αFP mRNA表达的影响

　　LH37处理组αFP  mRNA表达量明显低于对照组，说明LH37作用48 h对SMMC7721 细胞αFP mRNA表达量有YZ作用，其中LH37(1×10-5 mol/L)处理组诱导SMMC7721细胞αFP mRNA表达量明显低于LH37( 1×10-6 mol/L)处理组. RA和DMSO（1×10-5 mol/L）对SMMC7721 细胞αFP mRNA表达也有YZ作用(图3).

　　2.4 LH37对SMMC7721细胞ALP酶活性的影响

　　经LH37和维甲酸处理的SMMC7721细胞ALP酶活性均有不同程度的提高. LH37（1×10-6 mol/L)处理组比对照组提高24.98% ［（1.131±0.033） vs （0.830±0.032）, P<0.01］, LH37（1×10-5 mol/L)处理组比对照组提高15.69% ［（1.019±0.062） vs （ 0.830±0.032）, P<0.05］,而RA（1×10-5 mol/L)处理组比对照组提高20.09% ［（1.072±0.027） vs （ 0.830±0.032）, P<0.01］.

　　3 讨论

　　应用MTT 比色法定量测定化合物对癌细胞的生长YZ程度已成为药物筛选的常规基础手段. LH37作用48 h能YZSMMC7721细胞的生长，且YZ作用具有药物浓度依赖性. 随着LH37浓度的升高， 对细胞的YZ作用增强. 提示LH37可以直接作用于SMMC7721细胞， 有显著的细胞增殖YZ作用.
     
　　形态学上的分化成熟是表明恶性肿瘤细胞分化的标志. 肝癌细胞分化不良在形态学上主要表现为细胞增大深染、核大、核仁多、呈多型性等. 而核、浆比例失常是区别癌变肝细胞和肝细胞良性增生的主要根据. 在培养人肝癌细胞中加LH37后,发现细胞形状趋向规则，核明显变小，核仁明显减少，核浆比减小，表明结构上趋向分化的改变，这一过程与人胎肝干细胞的体外培养及诱导分化部分相似［6］.
　　
　　αFP是公认的肝细胞增殖和恶变的重要标志物. LH37诱导后细胞内αFP mRNA 表达明显下降，作用效果类似RA. ALP除作为畸胎瘤和癌细胞的分化标志外［7］，在多种具有分化诱导作用的化合物作用下，肝癌细胞的ALP活性亦可明显ZG［8］. 本研究选用ALP作为肝癌细胞分化的功能指标，结果显示LH37诱导后ALP活性升高, 与RA作用一致. 三氮唑席夫碱衍生物诱导肿瘤细胞分化的作用机理尚不清楚，氨基均三唑类化合物可明显提高肿瘤细胞SOD活性并降低过氧化氢酶活性，使细胞内H2O2含量升高，从而推测三氮唑席夫碱衍生物诱导肿瘤细胞分化的作用可能与H2O2作用有关［9］.

　　综上所述，本研究应用肝癌细胞分化的不同指标，揭示了LH37具有显著YZ人肝癌细胞增殖和诱导分化的作用. LH37是一种潜在的癌细胞分化诱导剂，其抗肿瘤作用具有一定的研究和应用前景.

【参考文献】
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　　［2］Jantova S, Letasiova S, Ovadekova R,et al. Cytotoxic/antiproliferative effects of new ［1,2,4］triazolo［4,3c］ quinazolines in tumor cell lines HeLa and B16 ［J］. Neoplasma, 2006,53 (4)：291-300.

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　　［4］朱海英, 张朵, 谢东甫,等. 人肝癌细胞系P22HCC的建立及体外诱导分化特性的初步研究［J］. 第二军医大学学报，2005,26 (3)：247-250.

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　　［6］郑启昌,胡安斌. 胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的研究及思路［J］.中华医学杂志,2004，84(16):16.

　　［7］Fanjul M, Theveniau M, Palecoby C, et al. Expression and characterization of alkaline phosphatases during differentiation of human pancreatic cancer (Capan1) cells in culture ［J］. Biol Cell, 1991,73(1):15-25.

　　［8］曾小莉，涂植光. 人参皂甙RH2对人肝癌细胞SMMC7721的诱导分化作用［J］.癌症，2004,23（8）：879-884.

　　［9］Sun YX, Zheng QS, Li G, et al. Mechanism of ascorbic acidinduced reversion against malignant phenotype in human gastric cancer cells ［J］. Biomed Environ Sci, 2006,19(5): 385-391.