大肠杆菌（E. coli）表达系统重组蛋白表达与纯化_详细资料

产品信息 提供商：生工生物工程服务名称：大肠杆菌（E. coli）表达系统重组蛋白表达与纯化 步骤1. 目标基因全基因合成： 1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。 2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。 3.合成设计好的基因序列。 交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。 时间：2周 步骤2. 目标基因亚克隆： 1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。 2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。 3.测序验证构建质粒的准确性。 4.可提供表达载体（PET系列为主） 交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。 时间：2-3周 步骤3. E. coli 表达菌株转化及筛选： 1.扩增并抽提构建好的表达质粒。 2.将表达质粒转化到GX的E. coli表达菌株中。 3.至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件，SDS-PAGE 检测蛋白表达情况，筛? 选出合适菌株。 4.可提供表达菌株：DH5α, Top10, JM115, BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLys, XL1 Blue等。 交付内容：重组质粒的表达菌株及表达检测报告。 时间：2-3周 步骤4. 目标蛋白表达及纯化： 1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋白。 2.摇瓶培养1L重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法纯化表达的重组蛋白。 3.利用蛋白酶去除不需要的纯化标签（Tag），再纯化获得所需的目标蛋白（可选，构建表达载体需加入合适的蛋白酶切位点）。 4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制产品质量。 5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性 交付内容：纯化好的目标蛋白5~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的蛋白，纯度可达95%以上。 时间：2-3周 说明： 1. 如果没有获得目标蛋白，只收取一定的成本费。如果得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。 2. 如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收相应费用。 3. 因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们根据实际情况将给客户提供Z少5mg，Z多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。 4. 我们提供的产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的。 5. 每次Western-blot检测Z多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。 步骤5. 目标蛋白的再加工及详细检测： 1.对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究。 2.内毒素去除，CJ，冻干等进一步加工。 3.通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量 服务内容： 1：复性研究：利用多达20种不同复性缓冲液的体系，对目标蛋白进行小量复性试验提供复性后样品供客户检测，可 根据客户要求，按照其中一种样品的复性条件制备小量的复性蛋白，可提供具体的复性缓冲液配方及复性工艺。 2：除内毒素， 3：过滤CJ， 4：冻干，5：HPLC检测， 6：质谱检测， 7：N端测序。 交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。 时间：2-3周 步骤6. 大规模制备： 按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。 交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。 时间：协商

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