Transwell 细胞迁移实验实验步骤:1. 将transwell小室反面朝上,架在24孔板上,每个transwell小室底面“涂”10μl 纤维连接蛋白(0.5mg/ml),在超净台内风干(大约1小时),使纤维连接蛋白固化于膜底面。将transwell小室放回24孔板孔内。2. 消化细胞并计数,取105个细胞置于1.5mlEP管中,2000rpm离心5分钟,去上清,加入200μl无血清培养基重悬细胞,加入transwell小室中。下层小室加入10%FBS的RPMI1640培养基。放入37℃孵箱中培养5个小时。
3. 染色:
①取出insert, 用棉签擦除里面的细胞,并用PBS(用600微升放在另一个孔中)轻轻洗掉insert里面剩余细胞,然后取出insert放纸上把多余的水吸净。
②取出transwell小室,用棉签擦除里面的细胞,并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。用甲醇、冰醋酸按照3:1配制成混合液,固定transwell小室反面的细胞10分钟。
用结晶紫染色剂染色并固定15分钟。
③自来水轻轻涮洗insert,3-5次即可。(如果正面能看见颜色,就用棉签檫一下檫干净。)
④用滤纸吸干insert里残留的水,放在通风橱中风干1分钟。⑤手术刀片,小心沿小室边缘将膜剔下,反面朝上放在载玻片上。
立即滴二甲苯约15µl于膜上,倾斜载玻片,用滤纸吸走多余的二甲苯。滴中性树胶约15µl于膜上,加盖玻片,排除气泡。
4. 显微镜下将每张膜随机取5个视野进行拍照,随后观察计数,平均值即为该膜一个视野所通过膜的细胞数平均值。
5. 赛尔生物细胞Transwell 迁移实例:
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